论文摘要
目的:人乳头瘤病毒（human papillomaviruses, HPV）可使感染部位产生良性和恶性病变,根据其致瘤性的不同可分为低危型和高危型两大类。高危型别的HPV感染与子宫颈癌的发生关系十分密切,其中50%的子宫颈癌与高危型别中的HPV16感染有关。目前手术和放化疗是子宫颈癌临床采用的主要方法,为防止疾病复发,术后采用免疫治疗成为当前研究的热点。DNA疫苗为防止HPV16感染而引起子宫颈癌术后复发提供了可能性。目前子宫颈癌基因疫苗的研究通常以HPV的早期蛋白E6/E7作为靶抗原,该疫苗虽能在一定程度上增强特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lympho-cyte, CTL）反应,但不能诱导产生特异性CD4+T辅助细胞,使疫苗的应用受限。因此如何增强抗原的免疫原性成为研究的热点。树突细胞（dendritic cells, DCs）作为机体最重要的抗原提呈细胞（Ag-presenting cells, APCs）在诱发免疫应答过程中处于核心地位。DCs在抗原产生部位数量的不足,限制了抗原被APCs的提呈,降低了抗原的免疫原性。应用DCs特异性招募因子和特异性生长因子提供双重信号来增加抗原产生部位DCs的数量,为HPV16E7 DNA疫苗的进一步研究提供了新思路。巨噬细胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein-1α, MIP-1α）最早是在经LPS（lipopolysaccharide, LPS）诱导的巨噬细胞培养上清中发现的分子量为800014000的趋化因子。当其与受体CCR1、CCR4、CCR5结合后,可趋化包括单核细胞/巨噬细胞、T淋巴细胞、树突状细胞和嗜酸性粒细胞在内的多种免疫效应细胞,并对单核细胞、T淋巴细胞及B淋巴细胞有免疫调节作用。此外,MIP-1α可诱导IFN-γ的产生,是一种激活Th1型免疫反应的有效佐剂。酪氨酸激酶受体3配体（Fms-like tyrosine kinase 3 ligand, Flt3l）是1993年首次发现并被成功克隆的一种早期造血细胞生长因子,它与干细胞因子（SCF）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）有部分同源性。骨髓基质细胞和T细胞可表达有功能的Flt3l蛋白,当其与酪氨酸激酶受体3（fms-like tyrosine kinase 3 receptor, Flt3R）结合后,使酪氨酸激酶被激活,进而发挥生物学作用。由于成熟DCs不表达Flt3R,不成熟DCs才表达Flt3R,因此Flt3l可以选择性地扩增DCs前体细胞数量,并促进其成熟,使诱导衍生的DCs形态呈典型的树突状,摄取和加工抗原的能力明显加强,是体内外刺激DCs生成的最强大和最重要的细胞因子之一。本研究构建了真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/Flt3l,将其与pcDNA3/HPV16E7基因疫苗共注射C57BL/6小鼠,观察脾脏CTL的杀伤作用及小鼠抵抗TC-1肿瘤细胞攻击的能力。方法:（1）从烫伤小鼠脾脏提取总RNA,用RT-PCR法扩增MIP-1α片断。用PCR法从携带HPV16E7的质粒中扩增HPV16E7片段;（2）将两种基因的扩增产物分别与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,接种含氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）的2YT培养基,挑取菌落、提取质粒进行酶切鉴定和测序筛选重组子;（3）经酶切鉴定和测序确认后,从这两种克隆载体切取目的基因片段。将目的基因片段MIP-1α和HPV16E7分别与经相同内切酶酶切的pcDNA3载体连接,构建真核表达重组质粒pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7;（4）从携带Flt3l的质粒切取Flt3l目的基因片段,与经相同的内切酶处理的pcDNA3载体连接,构建真核表达重组质粒pcDNA3/Flt3l,转化大肠杆菌DH5α,接种含Amp的2YT培养基,挑取菌落、提取质粒进行酶切鉴定和测序筛选阳性重组子;（5）用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/ HPV16E7、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3,用聚乙二醇（PEG）沉淀法进行纯化;（6）动物实验:将68周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,每组14只;5组分别为pcDNA3组、pcDNA3/HPV16E7组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组、pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组。纯化后的质粒以生理盐水稀释,股四头肌肉注射免疫小鼠,每次每只小鼠接种每种质粒50μg,不足150μg时用pcDNA3质粒补足,每3周免疫1次,共免疫3次;末次免疫后两周每组随机抽取6只小鼠,无菌条件下取出脾脏,用CCK-8试剂盒检测其对TC-1靶细胞的特异性杀伤能力。其余小鼠在腹股沟皮下注射5×104个TC-1细胞使小鼠成瘤,一周后隔日观察小鼠成瘤情况,一个月后每周观察一次,记录肿瘤生长情况。小鼠成瘤后随机抽取不同处理组的肿块,制备石蜡切片,HE染色,观察各组小鼠肿块组织细胞的病理学形态。结果:（1） RT-PCR法扩增出MIP-1α基因片段,其长度与预期值相符; （2）成功构建原核表达质粒pGEM-T/HPV16E7和pGEM-T/MIP-1α,DNA测序证实目的基因序列与Genebank登录序列相同;（3）基因片段插入pcDNA3后酶切结果证实成功构建了真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/HPV16E7和pcDNA3/Flt3l;（4）免疫小鼠对TC-1靶细胞的特异性杀伤百分率分别为:pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组88.83%, pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组76.00%, pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组76.33%, pcDNA3/HPV16E7组79.00%, pcDNA3组65.33%。单因素方差分析提示5组之间有明显差异（P<0.01）,两两比较可得:pcDNA3组的特异性杀伤百分率明显低于其他各组,差异有统计学意义（P<0.05）;pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组的特异性杀伤百分率高于其他各组,差异有统计学意义（P<0.05） ; pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/ HPV16E7混合组及pcDNA3/HPV16E7组三组间无统计学差别（P>0.05）; （5）用TC-1肿瘤细胞攻击小鼠后16天,pcDNA3组小鼠全部长出肿瘤,而pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7三种质粒混合组的成瘤率仅为12.5%,明显低于其他组,统计学分析示5组之间成瘤率差异有显著性（P=0.005）。两两比较示:pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组与pcDNA3组之间有统计学差别（P=0.001） ; pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/ HPV16E7混合组与pcDNA3/HPV16E7组之间有统计学差别（P=0.041） ; pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组与pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组两者之间有统计学差别（P=0.041）;其余各组间差别无统计学意义（P>0.05）。60天后各组之间成瘤率的差异无统计学意义（P=0.229）;（6）小鼠肿块组织的病理学观察示:典型的肿瘤细胞形态。结论:（1）用烫伤法成功克隆了小鼠MIP-1α基因片段;（2）成功构建了原核表达质粒pGEM-T/HPV16E7和pGEM-T/MIP-1α; （3）成功构建了真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/HPV16E7和pcDNA3/Flt3l;（4） pcDNA3/Flt3l、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7三种质粒混合疫苗免疫效果优于pcDNA3/HPV16E7 DNA疫苗,在一定程度上延缓了肿瘤的发生;（5） pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合疫苗未能增强pcDNA3/HPV16E7 DNA疫苗的免疫效果; （6） pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/ HPV16E7混合疫苗未能增强pcDNA3/HPV16E7 DNA疫苗的免疫效果。
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