介体白背飞虱与南方水稻黑条矮缩病毒P7-1互作蛋白鉴定与功能的初步研究

论文摘要

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）的暂定种,其在水稻上引起的病毒病害最早在2001年发现于中国广东省阳江市。在过去的十年间,SRBSDV在中国南部、越南北部、韩国、日本和泰国等地迅速传播,给水稻生产带来了巨大损失,已成为东亚和东南亚地区最重要的水稻病毒病害之一。SRBSDV主要由白背飞虱（Sogatella furcifera Horvath, WBPH）以持久增殖方式传播。白背飞虱作为一个典型的远距离迁飞性害虫,可将该病毒迅速传播扩散导致水稻病毒病的继发侵染和严重暴发。本研究利用了酵母双杂交系统对SRBSDV的P7-1小管蛋白和白背飞虱的蛋白进行了互作研究。首先构建了白背飞虱的cDNA表达文库,然后以SRBSDV的P7-1为诱饵蛋白对该cDNA文库进行了酵母双杂交筛选。初次筛选获得了153个可能互作的蛋白,将这些筛选到的蛋白经过Blast2go数据库进行了比对,这些序列最佳匹配的物种分布为12%的蛋白与点蜂缘蝽（Riptortus pedestris）同源,7%的蛋白与赤拟谷盗（Tribolium castanetum）同源,7%的蛋白属于白背飞虱,6%的蛋白与体虱（Pediculus humanus corporis）同源。对153个蛋白进行了GO注释功能分析,依据不同的生物途径可以分为10类,依据细胞组分可以分为6类,依据分子功能可以分为17类。根据分子功能和细胞组分的分析,本研究选取了24个候选蛋白进行酵母双杂交再次验证,经β-半乳糖苷酶显色分析,最终获得了18个与P7-1互作的蛋白。根据酵母双杂交的实验结果,我们进一步利用化学发光免疫共沉淀技术研究了这18个蛋白与P7-1的互作。结果表明其中7个蛋白与P7-1有较强的相互作用,分别为神经胶质蛋白（neuroglia）,肌球蛋白轻链2（MLC2）,几丁质结合结构域4（chitin bind4）,E3泛素蛋白连接酶MARCH5（E3ligase）,多聚泛素（polyubiquitin）,核糖体结合蛋白Ⅱ（ribophorin Ⅱ）和抑制蛋白（profilin）,其互作强度分别为阴性对照的13,12,7,6.8,6.6,6.3和5.6倍。另外11个蛋白与P7-1的互作强度为阴性对照的2-4倍左右。在GO注释功能分析中,这7个互作较强的蛋白在生物体内分别参与了蛋白质结合,蛋白质翻译后修饰,蛋白质的翻转和折叠,脂类物质运输和代谢,能量的合成及转换,蛋白质的生物合成以及细胞骨架的形成等。本研究从7个互作较强的蛋白中选取了neuroglia, MLC2, E3ligase, polyubiquitin, ribophorinⅡ和profilin6个蛋白,并对这些蛋白的基因表达进行了荧光定量PCR分析。其中neuroglia, MLC2, E3ligase, polyubiquitin和profilin在雄性成虫体内的mRNA表达量要远远高于在雌性成虫和幼虫。而ribophorin Ⅱ在雌性成虫体内表达量要高于雄性成虫和幼虫。同时还检测了这6个蛋白在白背飞虱5个不同组织内的mRNA表达情况,结果表明neuronglia, MLC2, polyubiquitin和profilin在肠道的表达量最高,ribophorin Ⅱ主要在唾液腺的表达量较高,而E3ligase则在血淋巴中的表达量最高。同时,本研究选取了4个蛋白neuroglia, MLC2, E3ligase和profilin进行了抗体制备,并利用间接ELISA对其白背飞虱体内不同组织的表达进行检测。检测结果表明neuroglia在肠道的表达量最高,其次是在血淋巴中,而在唾液腺中未检测到。MLC2和profilin均在肠道的表达量最高,其次是在唾液腺中,而在血淋巴中检测不到。E3ligase则是在血淋巴中的表达量最高,其次是在唾液腺和肠道。ELISA的检测结果与qRT-PCR的检测结果一致。本研究结果表明neuroglia, MLC2, E3ligase和profilin这4个蛋白可能参与了病毒在介体白背飞虱内不同组织趋向性的运动。为了进一步解析SRBSDV的P7-1蛋白与白背飞虱蛋白的互作功能,我们选取了MLC2作为模式研究,利用荧光共聚焦显微镜进行了组织定位观察。研究结果表明在介体昆虫获毒后第4天和第8天,可以检测到小管蛋白P7-1和MLC2沿着介体的中场肌肉层紧紧贴在一起。而直到介体获毒8天时才在副唾液腺检测到P7-1和MLC2紧贴在一起,在获毒4天的时候则检测不到。这说明MLC2蛋白可能参与了病毒在介体内的运输。为了进一步阐明白背飞虱MLC2的功能,我们扩增得到了该蛋白的基因。MLC2的cDNA全长为1030bp开放阅读框为624bp,可以编码207个氨基酸。聚类分析表明该蛋白与半翅目昆虫的肌球蛋白轻链2有67%的同源性,与双翅目昆虫的肌球蛋白轻链有54-59%的相似性。MLC2蛋白包括两个‘’EF-hand"结构域。将该蛋白序列与其他已知的脊椎动物和无脊椎动物的MLC-2序列进行进化树分析,结果表明该基因具有潜在的研究价值。本研究所发现的6个白背飞虱蛋白可能参与了SRBSDV在介体昆虫内的传播,为揭示病毒在介体昆虫内传播的分子机制提供了新的见解。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• Abbreviations
• List of Figures
• List of Tables
• CHAPTER Ⅰ Literature review
• 1.1 Discovery and impact of Southern rice black-streaked dwarf disease
• 1.2 Genome and structure of SRBSDV
• 1.3 The vector of SRBSDV-Sogatella furcifera
• 1.3.1 Vector taxonomy and characteristics
• 1.3.2 Vector's life cycle
• 1.4 Characteristics of SRBSDV-WBPH-plant host interaction
• 1.5 Plant virus transmission by insect vector
• 1.5.1 Mode of virus transmission by insect vector
• 1.5.2 Virus determinants and vector's components involved in virus transmission
• 1.6 Detection of Protein-protein interactions
• 1.6.1 The Split-ubiquitin yeast two hybrid system
• 1.6.2 Chemiluminescent Coimmunoprecipition（Co-Ip）
• 1.7 Objectives
• CHAPTER Ⅱ Investigation of protein interactors by yeast two hybrid system
• 2.1 Introduction
• 2.2 Material and Methods
• 2.2.1 Virus and insect vector sources
• 2.2.2 Construction of Sogatella furcifera cDNA library fusion vector
• 2.2.3 Construction of SRBSDVP7-1 bait fusion vector
• 2.2.4 Transformation of P7-1 bait fusion vector into yeast
• 2.2.5 Preparation of yeast cultures and protein extraction
• 2.2.6 SDS/PAGE and Western blotting
• 2.2.7 Verification of pDHB1-P7-1 expression
• 2.2.8 Optimization of basic screening conditions
• 2.2.9 Library screen and selection of interactor
• 2.2.10 Annotation and gene ontology（GO）classification
• 2.2.11 Confirmation of positive interactors
• 2.3. Results
• 2.3.1 Construction of S.furcifera cDNA library
• 2.3.2 Construction of P7-1 bait fusion vector
• 2.3.3 Verification of pDHB1-P7-1 expression by Western blot
• 2.3.4 Veilfication of bait fusion protein correct expression
• 2.3.5 Non-self activation test and optimization of library screen
• 2.3.6 Investigation of interactors by library screen
• 2.3.7 Annotation of bioinformatics and gene ontology（GO）classification
• 2.3.8 Confirmation of positive interactors in yeast
• 2.4. Discussion
• CHAPTER Ⅲ Identification of protein interactors by Chemiluminescent Co-IP system
• 3.1 Introduction
• 3.2 Materials and Methods
• 3.2.1 Cloning of AcGFP1-bait and pProLabel-prey
• 3.2.2 Cotransfection of AcGFPl-Bait and ProLabel-Prey into Mammalian Cells
• 3.2.3 Verification of AcGFP1-Bait expression and preparation of cotransfected cells
• 3.2.4 Verification of ProLabel-prey expression
• 3.2.5 Chemiluminescent CO-IP assay
• 3.3 Results
• 3.3.1 Construction of bait and prey fusion vectors
• 3.3.2 Verification of AcGFP1-bait and ProLabelC-Prey expression
• 3.3.3 Chemiluminescent coimmunoprecepitation（CO-IP）assay
• 3.4 Discussion
• CHAPTER Ⅳ Identification of mRNA expression level by qRT-PCR
• 4.1 Introduction
• 4.2 Materials and Methods
• 4.2.1. Gene expression analysis by qRT-PCR
• 4.3. Results
• 4.3.1 Gene expression analysis in different growth stages of S.furcifera
• 4.3.2 Gene expression analysis in different organs of S.furcifera
• 4.4 Discussion
• Chapter Ⅴ Protein expression analysis by Indirect-ELISA
• 5.1 Introduction
• 5.2 Materials and Methods
• 5.2.1 Preparation of antibody
• 5.2.2 Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）
• 5.3 Results
• 5.4 Discussion
• Chapter Ⅵ Functional analysis of myosin light chain 2
• 6.1 Introduction
• 6.2 Materials and Methods
• 6.2.1 Immunofluorescence microscopy analysis
• 6.2.2 Full-length gene amplification,Bioinformatics and Phylogenetic analysis
• 6.3. Results
• 6.3.1 Sub-cellular localization analysis ofMLC2 and P7-1 in insect organs
• 6.3.2 Sequence analysis of MLC 2 gene in S.furcifera
• 6.4 Discussion
• Chapter Ⅶ Discussion
• Chapter Ⅷ Conclusion
• References
• Acknowledgements
• Author biography
• Appendix