牛结核病原学调查及结核分枝杆菌体内诱导抗原研究

论文摘要

牛结核病(bovine tuberculosis,bTB)是主要由牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病,其中奶牛为最易感动物。近年来我国奶牛养殖业发展迅速,奶牛结核病在全国呈现不断蔓延趋势,该局面不仅严重阻碍着我国奶业的可持续发展,而且严重威胁食品安全和公共卫生。本实验对牛结核与人结核感染者进行细菌分离与鉴定,以期阐明牛结核与人结核间的分子流行病学联系,为人结核与牛结核的综合防治提供理论依据。体内诱导抗原技术是快速鉴定体内特异性表达抗原基因的高通量筛检技术。其原理是利用体外培养的病原微生物去除感染动物血清中针对体外表达抗原的抗体,再用此吸附血清作为探针来筛选病原微生物基因组表达文库中体内特异性表达抗原的基因,旨在为新药、新型疫苗和新型诊断方法研发提供新靶标,为进一步阐明病原体致病与免疫机理提供理论依据。采用常规结核菌培养方法,本研究共培养了806份奶牛鼻拭子样本,312份奶牛组织样本,分离了15株细菌。通过生化特性分析、多重PCR、spoligotyping和MIRU等,已鉴定了13株牛源人型结核分枝杆菌与1株牛型分枝杆菌。扑杀了其中2头阳性牛,大体病理学与组织病理学证实其为结核阳性牛,病变肺组织中的细菌分离培养结果证实了1株人型菌和1株牛型菌。同时对华中地区某结核病医院和结核病防治所从收治的结核病人痰标本中分离的84份菌株进行了基因型鉴定,结果全部为结核分枝杆菌,未发现牛分枝杆菌。对该医院过去三年的病人档案进行了回顾性调查,从5011例病人中发现17例为牛分枝杆菌感染,感染率为0.34%(17/5011)。收集了具有不同结核抗体水平的临床感染奶牛血清,按高、中、低等级分别将4份抗体水平接近的奶牛血清等量混合,制成探针血清库。培养结核分枝杆菌,收获细菌,分别以结核分枝杆菌与大肠杆菌的菌体、培养上清、及菌体超声裂解液吸附感染血清,用ELISA评价吸附效果。结核分枝杆菌的基因组表达文库转化大肠杆菌,用天鹅绒布转印至加IPTG的平板上,用吸附血清作为探针,进行杂交反应。用HRP标记羊抗牛二抗与DAB进行显色反应。共筛选了8000个克隆,对42个疑似阳性克隆进行测序鉴定,但未得到阳性克隆子。其原因有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 1 前言
• 1.1 牛结核病的危害
• 1.2 牛结核病的病原学
• 1.3 牛结核病的流行病学
• 1.4 牛分枝杆菌免疫与致病机理
• 1.5 机体抗牛分枝杆菌感染的防御机理
• 1.6 牛结核病的诊断
• 1.6.1 牛结核病诊断抗原的研究
• 1.6.2 牛结核病诊断方法的研究
• 1.7 结核杆菌体内表达基因的筛选
• 1.7.1.原理
• 1.7.2 体内诱导抗原的优点和缺点
• 1.7.3 展望
• 2 材料与方法
• 2.1 样本采集与牛结核病病原学调查
• 2.1.1 ELISA抗体检测
• 2.1.2 IFN-γ体外释放实验
• 2.1.3 细菌培养
• 2.2 试验材料
• 2.2.1 文库及菌株
• 2.2.2 血清
• 2.2.3 主要试剂及材料
• 2.2.3.1 质粒抽提与鉴定试剂的配制
• 2.2.3.2 筛选所用试剂及配制
• 2.2.4 寡核苷酸引物
• 2.3 结核分枝杆菌的临床分离及分型鉴定
• 2.3.1 标本采集
• 2.3.2 标本的前处理
• 2.3.3 接种方法及结果判定
• 2.3.4 结核分枝杆菌的纯化培养
• 2.3.5 结核分枝杆菌的保存
• 2.3.6 分枝杆菌菌种的生化鉴定
• 2.3.7 PCR菌株分型
• 2.4 结核分枝杆菌基因组表达文库的构建
• 2.4.1 结核分枝杆菌H37Rv的培养及基因组DNA的提取
• 2.4.2 结核杆菌DNA的酶切及纯化
• 2.4.3 质粒的制备
• 2.4.4 表达载体pET30a、pET30b和pET30c的酶切及去磷酸化
• 2.4.5 目的基因与表达载体的连接
• 2.4.6 感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.4.7 质粒的转化
• 2.4.8 文库鉴定与保存
• 2.5 表达文库的筛选
• 2.5.1 制备用于筛选的血清
• 2.5.2 文库的筛选
• 2.5.3 阳性克隆重组质粒的测序及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 结核分枝杆菌的临床分离及分型鉴定结果
• 3.1.1 结核分枝杆菌的临床分离
• 3.1.2 牛分离菌株的分型鉴定
• 3.1.3 牛源人型结核菌牛群的流行病学调查
• 3.1.4 阳性牛扑杀结果
• 3.1.5 医院临床分离菌株的分型鉴定结果
• 3.2 结核分枝杆菌体内诱导抗原筛选结果
• 3.2.1 血清吸附效果检测
• 3.2.2 H37Rv基因组表达文库筛选及鉴定
• 4 讨论
• 4.1 结核分枝杆菌的临床分离及分型鉴定结果
• 4.1.1 结核分枝杆菌的临床分离
• 4.1.2 牛分离菌株的分型鉴定
• 4.1.3 医院临床分离菌株的分型鉴定结果
• 4.2 H37Rv基因组表达文库筛选
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢