首页> 正文

适合乳果糖制备的β-半乳糖苷酶高产株的筛选及产酶条件的优化

2020-12-06阅读(478)

适合乳果糖制备的β-半乳糖苷酶高产株的筛选及产酶条件的优化

论文摘要

乳果糖（lactulose）,又称作乳酮糖、异构乳糖,是由半乳糖和果糖以β-1,4糖苷键结合的二糖。乳果糖属于非消化性低聚糖,具有低甜度、低热能、低致龋齿性、选择性的促进人体肠道内有益菌增殖等生理学性质,在食品、保健品、药品的应用潜力很大。目前商业上生产乳果糖的方法是用化学合成法,但化学合成法存在很大缺点如:大量的有色副产物难以分离,分离这些副产物的成本较高并在分离的过程中使乳果糖降解,酶法合成乳果糖可以克服化学合成的缺点。本论文以筛选适合生产乳果糖的β-半乳糖苷酶高产菌株为目标,对产β-半乳糖苷酶的菌株诱变筛选、培养基及摇瓶培养条件优化、β-半乳糖苷酶酶学性质研究、筛选所得菌株发酵罐发酵条件的确定和酶法合成乳果糖的过程进行了系统的研究,实验结果表明:以乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）为出发菌株,物理诱变和化学诱变相结合的方法,5-溴-4-氯-3-吲哚-吡喃半乳糖苷（简称X-Gal）作为筛子,经过紫外诱变、超声诱变和甲基磺酸乙酯（EMS）诱变,筛选出一株具有较高转糖苷活力乳果糖高产菌株,菌株编号为乳酸克鲁维酵母K.lactis1-16-7。该菌株产生的β-半乳糖苷酶以ONPG为底物的酶活较诱变前提高了3.00倍,以乳糖为底物的酶活较诱变前提高了2.75倍,乳果糖产量可达44.88g/L。对该菌株培养基及培养条件进行了优化。优化后的培养基配方为酵母膏10.7g/L,蛋白胨F403为9.4g/L,乳糖12.1g/L,MgSO45.6g/L,KH2PO44.7g/L。最佳培养条件为培养温度30℃,pH6.0,装液量40mL/250mL,摇床转速160rpm,接种量6%,培养时间24h。在最佳条件下酶活最大可达10.64U/mL。乳酸克鲁维酵母K.lactis1-16-7β-半乳糖苷酶最适反应温度为40℃;最适pH为7.0;Na+、Cu2+对β-半乳糖苷酶有抑制作用,Co2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+对β-半乳糖苷酶具有激活作用,其中Mg2+的激活作用最大。在摇瓶发酵基础上进行了2L发酵罐扩大实验,对发酵罐扩大实验的培养基和发酵条件进行了优化。此时β-半乳糖苷酶酶活约为33.47U/mL,比摇瓶发酵提高了213.8%。以乳糖和果糖为底物,由乳酸克鲁维酵母K.lactis1-16-7β-半乳糖苷酶催化生成乳果糖的最佳反应条件为:乳糖和果糖的最佳比例为质量比为2:1摩尔比为1:1,乳糖和果糖的最佳浓度分别为40%（w/v）和20%（w/v）,加酶量为3U/mL,反应温度为50℃,反应体系pH为7.0,反应时间为10h。在此最佳反应条件下乳果糖的产量为57.83g/L。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 功能性低聚糖
  • 1.2 乳果糖
  • 1.2.1 乳果糖的生理学性质
  • 1.2.2 乳果糖的生产
  • 1.3 Β-半乳糖苷酶
  • 1.3.1 β-半乳糖苷酶应用现状
  • 1.3.2 β-半乳糖苷酶来源
  • 1.4 立题背景和意义
  • 1.5 论文主要研究内容
  • 第二章 适合乳果糖的Β-半乳糖苷酶高产株的筛选及培养条件的优化
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料与仪器
  • 2.2.1 实验材料
  • 2.2.2 试验仪器
  • 2.3 试验方法
  • 2.3.1 菌株
  • 2.3.2 培养基
  • 2.3.3 菌种活化
  • 2.3.4 菌悬液的制备方法
  • 2.3.5 菌株诱变的流程
  • 2.3.6 筛选方法
  • 2.3.7 粗酶液提取方法
  • 2.3.8 酶活测定方法
  • 2.3.9 诱变菌株的遗传稳定性试验
  • 2.3.10 薄层层析
  • 2.3.11 乳果糖的生成及反应产物的成分分析方法
  • 2.3.12 发酵培养基的优化方法
  • 2.3.13 培养条件的优化方法
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 诱变剂量的选择
  • 2.4.2 菌株诱变筛选结果
  • 2.4.3 遗传稳定性试验
  • 2.4.4 最佳发酵培养基配方的确定
  • 2.4.5 培养条件的优化
  • 2.4.6 乳酸克鲁维酵母突变株K.lacti51-16-7 所产β-半乳糖苷酶的特点
  • 2.5 本章小结
  • 第三章 K.LACT151-16-7Β-半乳糖苷酶酶学性质研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料与仪器
  • 3.2.1 实验材料
  • 3.2.2 试验仪器
  • 3.3 试验方法
  • 3.3.1 菌株
  • 3.3.2 培养基及培养条件
  • 3.3.3 粗酶液提取方法
  • 3.3.4 β-半乳糖苷酶的初步分离纯化
  • 3.3.4.1 硫酸铵分级沉淀
  • 3.3.4.2 透析
  • 3.3.4.3 酶液浓缩
  • 3.3.4.4 蛋白质浓度的测定
  • 3.3.5 酶活测定方法
  • 3.3.6 酶反应最适温度和热稳定性的研究
  • 3.3.7 酶反应最适pH 和pH 稳定性的研究
  • 3.3.8 金属离子对酶活的影响
  • 3.3.9 Lineweaver-Burk 双倒数法测定酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）
  • 3.3.10 酶的低温保藏稳定性
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 乳酸克鲁维酵母K.lacti51-16-7β-半乳糖苷酶的分离纯化
  • 3.4.2 乳酸克鲁维酵母K.lacti51-16-7β-半乳糖苷酶的基本酶学性质
  • 3.4.3 乳酸克鲁维酵母K.lacti51-16-7β-半乳糖苷酶的动力学参数
  • 3.4.4 酶的低温保藏稳定性
  • 3.5 本章小节
  • 第四章 2L 发酵罐的小试研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料与仪器
  • 4.2.1 实验材料
  • 4.2.2 试验仪器
  • 4.3 试验方法
  • 4.3.1 菌株
  • 4.3.2 种子液的培养
  • 4.3.3 发酵罐发酵
  • 4.3.4 菌体浓度的测定
  • 4.3.5 粗酶液提取方法
  • 4.3.6 酶活测定方法
  • 4.3.7 发酵液还原糖浓度的测定
  • 4.3.8 温度对发酵产酶的影响
  • 4.3.9 通气量对发酵产酶的影响
  • 4.3.10 搅拌速度对发酵产酶的影响
  • 4.3.11 补料对发酵产酶的影响
  • 4.3.12 改变初始碳源并补料对发酵产酶的影响
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 2L 发酵罐试验
  • 4.4.2 温度对发酵产酶的影响
  • 4.4.3 通气量对发酵产酶的影响
  • 4.4.4 搅拌速度对发酵产酶的影响
  • 4.4.5 不同发酵条件下产酶时间进程的比较
  • 4.4.6 补料对发酵产酶的影响
  • 4.4.7 改变初始碳源并补料对发酵产酶的影响
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 影响酶法合成乳果糖的因素
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验材料与仪器
  • 5.2.1 实验材料
  • 5.2.2 试验仪器
  • 5.3 试验方法
  • 5.3.1 酶反应生成乳果糖的条件
  • 5.3.2 底物浓度对乳果糖合成的影响
  • 5.3.3 加酶量对乳果糖合成的影响
  • 5.3.4 温度对乳果糖合成的影响
  • 5.3.5 反应体系pH 值对乳果糖合成的影响
  • 5.3.6 反应时间对乳果糖合成的影响
  • 5.3.7 高效液相色谱（HPLC）测定条件
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 乳果糖的测定
  • 5.4.2 乳果糖合成条件的优化
  • 5.4.2.2 加酶量对乳果糖合成的影响
  • 5.4.2.3 温度对乳果糖合成的影响
  • 5.4.2.4 反应体系pH 对乳果糖合成的影响
  • 5.4.2.5 反应时间对乳果糖合成的影响
  • 5.5 本章小结
  • 主要结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录A: 紫外诱变筛选菌株乳果糖合成的HPLC 图谱
  • 附录B: 超声诱变筛选菌株乳果糖合成的HPLC 图谱
  • 附录C: EMS 诱变筛选菌株乳果糖合成的HPLC 图谱
  • 附录D：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 相关论文文献

    • [1].乳果糖应用及研究进展[J]. 食品安全导刊 2019(06)
    • [2].低聚乳果糖酶法制备的研究进展[J]. 中国微生态学杂志 2012(01)
    • [3].乳果糖联用枯草杆菌肠球菌二联活菌多维颗粒剂治疗小儿功能性便秘61例临床分析[J]. 实用临床医学 2010(06)
    • [4].薄层色谱—蒽酮比色法定量测定低聚乳果糖含量[J]. 安徽农业科学 2009(05)
    • [5].乳果糖增加正常小鼠肠道益生菌群的种类和数量[J]. 基础医学与临床 2019(06)
    • [6].乳果糖生产方法及其在肉鸡生产中的应用[J]. 中国饲料 2018(19)
    • [7].高效液相色谱-蒸发光散射法测定酶法合成低聚乳果糖的含量[J]. 食品科学 2010(16)
    • [8].乳果糖对肝癌切除术后血浆内毒素血症及肝损伤的防护作用[J]. 中西医结合肝病杂志 2013(05)
    • [9].乳果糖联合胆宁片治疗老年慢性功能性便秘的疗效观察[J]. 心血管外科杂志(电子版) 2018(04)
    • [10].乳果糖在预防经尿道前列腺汽化电切术后患者便秘的效果观察[J]. 临床医药文献电子杂志 2016(57)
    • [11].乳果糖和乳杆菌的复合物对猪肠道环境和性能的影响[J]. 饲料博览 2014(01)
    • [12].低聚乳果糖的酶法制备研究进展[J]. 动物医学进展 2008(12)
    • [13].小麦纤维素联合乳果糖治疗儿童功能性便秘的临床观察[J]. 中国现代医学杂志 2018(36)
    • [14].乳果糖对断奶仔猪生长性能、养分消化率和粪便有害气体的影响[J]. 养猪 2019(05)
    • [15].低聚乳果糖对断奶大鼠肠道发育的影响[J]. 食品科学 2012(09)
    • [16].乳果糖用于经尿道前列腺电切术后预防继发性出血的效果观察[J]. 全科护理 2010(13)
    • [17].粪菌移植联合乳果糖对老年慢性功能性便秘的治疗效果[J]. 实用医学杂志 2019(17)
    • [18].乳果糖联合妈咪爱治疗儿童功能性便秘临床观察[J]. 中国社区医师(医学专业) 2010(27)
    • [19].黄枳胶囊联合乳果糖治疗化疗所致便秘20例临床观察[J]. 甘肃中医药大学学报 2019(02)
    • [20].乳果糖与小麦纤维素治疗妊娠期便秘的疗效对比观察[J]. 中国肛肠病杂志 2019(06)
    • [21].便秘灸联合乳果糖防治心脏瓣膜病患者术后排便困难的效果观察[J]. 基层医学论坛 2018(33)
    • [22].琥珀酸普卢卡必利联合乳果糖对老年女性难治性便秘的疗效[J]. 现代诊断与治疗 2019(08)
    • [23].芪蓉润肠口服液与乳果糖对肛肠术后患者排便功能的影响[J]. 中国现代医药杂志 2019(08)
    • [24].不同加热条件对牛奶糠氨酸、乳果糖含量的影响[J]. 现代食品 2019(17)
    • [25].小柴胡汤联合乳果糖治疗功能性便秘伴抑郁的临床观察[J]. 中国中医药现代远程教育 2018(03)
    • [26].乳果糖联合莫沙比利治疗老年人功能性便秘疗效评价[J]. 中国药物经济学 2013(S1)
    • [27].乳果糖与食醋保留灌肠治疗肝性脑病的临床观察[J]. 长治医学院学报 2008(01)
    • [28].乳果糖益生元效应的临床应用进展[J]. 胃肠病学 2019(07)
    • [29].乳果糖口服液治疗功能性便秘疗效的系统评价[J]. 中国老年学杂志 2015(22)
    • [30].慢性乙型病毒性肝炎(重度)患者肠黏膜屏障功能的变化及不同干预措施的临床观察[J]. 临床消化病杂志 2009(04)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  ;  

    适合乳果糖制备的β-半乳糖苷酶高产株的筛选及产酶条件的优化
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5