乙型肝炎表面抗原主蛋白改变HepG2细胞脂代谢基因表达

论文摘要

目的：通过SHBs稳定转染HepG2细胞，观察SHBs蛋白对肝细胞及细胞中ECHS1、PPARɑ及其调控下游基因表达的影响，为研究SHBs的生物学功能提供新线索，探讨HBV感染者脂肪肝的形成机理。方法：以C型HBV全S基因为模板，PCR扩增主S基因（SHBs基因），定向克隆至pcDNA3.1（+）载体中，构建真核表达质粒pcDNA3.1-SHBs；确定HepG2细胞G418的最佳筛选浓度，重组质粒pcDNA3.1-SHBs与空质粒pcDNA3.1分别转染HepG2细胞，G418筛选出稳定转染细胞株，通过RT-PCR和ELISA方法检测稳定转染细胞系中SHBsmRNA和蛋白以验证获得的表达细胞株，并用实时定量PCR和Western-Blot方法检测稳定转染细胞株中脂质代谢相关基因mRNA及蛋白水平表达差异。结果：成功构建出SHBs真核表达质粒pcDNA3.1-SHBs。确定HepG2细胞G418的最佳筛选浓度为1000ug/ml。以G418筛选出稳定转染肝癌HepG2细胞，并成功建立稳定表达目的蛋白的HepG2-pn3.1-SHBs细胞及空质粒对照的HepG2-pn3.1-neo。RT-PCR和ELISA方法检测到HepG2-pn3.1-SHBs细胞株中目的蛋白SHBs的表达，稳定转染后的HepG2-pn3.1-SHBs细胞株持续表达SHBs。与HepG2-pn3.1-neo细胞相比，HepG2-pn3.1-SHBs细胞中细胞培养上清中转氨酶ALT、AST的含量较高[（46.80±4.78）vs（39.21±2.81）；（64.72±5.45）vs（54.58±1.20）,（p<0.01）]，细胞裂解液中CHO含量较高[（0.87±0.04）vs（0.87±0.04）,（p<0.01）]，而TG含量较低[（1.39±0.65）vs（0.58±0.05）,（p<0.01）]。实时定量PCR结果显示：与HepG2-pn3.1-neo细胞相比，HepG2-pn3.1-SHBs细胞中基因ECHS1、APOA1、LPLmRNA表达水平较低[（0.161±0.043）vs（0.210±0.022）,（p<0.05）；（0.031±0.007）vs（0.094±0.055）,（p<0.05）；（0.770±0.036）vs（0.982±0.031）]，基因ACC、SREBP-1cmRNA水平较高[（0.113±0.027）vs（0.059±0.022）,（p<0.01）；（0.019±0.002）vs（0.015±0.001）,（p<0.05）],差异有统计学意义，基因CPT1a、PPARα的转录水平差异虽无统计学意义，但呈减弱趋势[（0.028±0.005）vs（0.030±0.004）；（0.014±0.004）vs（0.015±0.002）]。Western-Blot结果显示上述基因蛋白水平的变化趋势与mRNA一致。Western-Blot结果显示上述基因蛋白水平的变化趋势与mRNA一致。结论：结果表明SHBs对肝细胞可以造成一定的损害作用，并干扰脂肪酸代谢，在转录和蛋白水平明显改变脂肪酸合成、分解相关基因的表达，但HBsAg是否直接导致肝细胞脂肪变性尚不明确，值得进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 SHBs基因稳定转染HepG2细胞系的建立
• 一. 材料
• 1. 仪器
• 2. 细胞与菌种、质粒
• 3. 主要试剂
• 二. 方法
• 1. SHBs基因片段获得
• 2. 构建真核表达质粒pcDNA3.1-SHBs
• 3. 重组质粒pcDNA3. 1-SHBs稳定转染HepG2细胞
• 三. 结果
• 1. SHBs基因PCR扩增产物鉴定
• 2. 目的质粒pcDNA3.1-SHBs鉴定结果
• 3. HepG2细胞6418最佳筛选浓度确定试验
• 4. 重组HepG2细胞系中SHBs基因mRNA检测
• 5. ELISA方法检测SHBs蛋白
• 6. 稳定转染细胞株SHBs蛋白分泌周期测定
• 四. 讨论
• 第二部分 SHBs对肝细胞及其脂质代谢基因的影响研究
• 一. 材料
• 1. 器材
• 2. 细胞与主要试剂
• 二.方法
• 1. 细胞的处理
• 2. 稳定转染细胞转氨酶及脂质水平检测
• 3. 实时定量PCR检测肝细胞内相关基因mRNA水平表达差异
• 4. Western blot方法检测细胞中蛋白水平
• 三.结果
• 1. 稳定转染细胞转氨酶及脂质水平检测结果
• 2. 实时定量PCR结果
• 3. Western blot结果
• 四.讨论
• 小结
• 参考文献
• 英文缩略词
• 致谢
• 综述
• 参考文献