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虫草有性型及其无性型关系的分子确证

2020-12-06阅读(458)

虫草有性型及其无性型关系的分子确证

论文摘要

虫草属真菌寄主范围较狭窄,但其生活史中存在着有性型和无性型两种不同阶段,在两者对应关系的确证上,Koch法则最可靠,即把无性型接种到相应的寄主上培养出子实体,但由于很多虫草的天然生长条件很难模拟,难以培养出子实体,所以很难推广应用,其它几种生物学的确证方法也都各有其局限性。然而,近些年来,分子生物学手段在虫草有性型及无性型对应关系的确证方面逐渐显示出良好的应用前景。ITS区是rDNA转录单位的一个部分,它是由两个不编码的ITS1和ITS2构成,由于ITS区相对较短,PCR容易将其扩增,且该区在属内种间具长度的保守性和核苷酸序列的高度变异性。因此,利用测定并比较虫草有性型标本及其假定无性型的DNA ITS区序列以确证两者的对应关系,从而弥补一般生物学确证的不足。在生物学确证和形态学鉴定的基础上,本文通过对核糖体ITS区序列(rDNA ITS)的分析,研究了部分虫草无性型菌株及有性型标本之间的对应关系,并对一些虫草的无性型进行了形态学的培养观察。本论文的主要研究结果如下:台湾虫草和其无性型黄山被毛孢的ITS区序列完全一致,从分子水平上进一步确证了它们之间的对应关系。在黄山被毛孢和被毛孢属的其它种所作的系统进化树上,台湾虫草和黄山被毛孢在一个分支上,支持率为100%,系统发育树可分为两个主要分支,一支由C.sinensis、H.sinensis、C.cochlidiicola、C.heteropoda和H.rhossiliensis构成,另一支有C.formosana、H.huangshanensis和C.heteropoda构成。可见台湾虫草和黄山被毛孢是同一物种生长的不同阶段,即黄山被毛孢为台湾虫草的无性型,台湾虫草的无性型归为被毛孢属较为合理。根足虫草琅琊山变种和其无性型根足被毛孢的ITS区也完全一致。在根足被毛孢和被毛孢属的其它种所作的系统进化树上,根足虫草琅琊山变种和根足被毛孢在一个分支上,且支持率为100%,而和被毛属其它种的差异明显,和白僵菌属及绿僵菌属差异则更显著。可见,根足被毛孢是根足虫草琅琊山变种的无性型,其归为被毛孢属较为合理。这和形态学的研究结果相一致。对粉被玛利亚霉、蚁被毛孢、紫色野村菌、细脚拟青霉、长座被毛孢,以及草剃虫草和珊瑚虫草的假定无性型的序列进行了测定和分析,结果表明:它们分别是粉被虫草、蚁虫草、柱形虫草、高雄山虫草、长座虫草的无性型,草剃虫草和珊瑚虫草的无性型分离正确。本室以前鉴定的双梭孢虫草应是粉被虫草。粉拟青霉和蝙蝠蛾拟青霉的序列相似度很高,可能是同物异名。通过和GenBank数据库比对发现珊瑚虫草与Pochonia属真菌的序列相似率比较高,这与形态学的鉴定结果也相一致。草剃虫草的序列与GenBank数据库登录的绿僵菌属和轮枝孢属的序列较为接近,其无性型的归属还有待于进一步的研究。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 文献综述
  • 1 研究目的
  • 2 研究依据
  • 3 研究背景
  • 4 以核糖体DNA基因簇为靶分子的研究方法
  • 5 研究进展
  • 5.1 虫草无性型研究进展
  • 5.2 种间关系及其与寄主的联系
  • 5.3 菌物分子系统学研究进展
  • 5.4 ITS区研究进展
  • 引言
  • 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 有性型标本及无性型菌株
  • 1.2 主要仪器设备
  • 1.3 主要试剂及配置
  • 2.实验方法
  • 2.1 DNA提取（氯化苄法）
  • 2.2 DNA检测
  • 2.3 ITS1-5.8S rDNA-ITS2区特异性PCR扩增及测定
  • 2.3.1 ITS区域扩增引物
  • 2.3.2 PCR扩增反应体系
  • 2.3.3 PCR扩增反应的循环参数
  • 2.3.4 扩增产物的检测
  • 2.3.5 序列测定
  • 2.3.6 序列分析及系统发育树的构建
  • 2.4 形态学观察
  • 2.4.1 接种
  • 2.4.2 培养
  • 结果与分析
  • 1 台湾虫草及其无性型关系的分子确证
  • 1.1 DNA纯度的检测
  • 1.2 PCR扩增产物的电泳检测
  • 1.3 ITS序列的分析
  • 2 根足虫草琅琊山变种及其无性型关系的分子确证
  • 2.1 DNA纯度的检测
  • 2.2 PCR扩增产物的电泳检测
  • 2.3 ITS序列的分析
  • 3 蝙蝠蛾拟青霉和粉拟青霉的比较研究
  • 3.1 分子生物学方法的比较研究
  • 3.2 形态学方法的比较研究
  • 4 两种子囊孢子呈双梭型虫草的形态学比较
  • 4.1 分子生物学方法的比较研究
  • 4.2 形态学方法的比较研究
  • 5 蚁虫草、柱形虫草及其无性型关系的分子确证
  • 5.1 ITS序列的分析
  • 6 草剃虫草Cordyceps kusanagiensis Kobayasi & Shimizu 及其无性型关系的分子确证
  • 6.1 DNA纯度的检测及PCR扩增产物的电泳检测
  • 6.2 ITS序列的分析
  • 7 珊瑚虫草及其无性型关系的分子确证
  • 7.1 珊瑚虫草无性型培养特征观察
  • 7.2 DNA纯度的检测
  • 7.3 PCR扩增产物的电泳检测
  • 7.4 ITS序列的分析
  • 8 长座虫草及其无性型关系的分子确证
  • 8.1 DNA纯度的检测
  • 8.2 PCR扩增产物的电泳检测
  • 8.3 ITS序列的分析
  • 9 来自泰国的几个菌株的分子生物学分析和形态学观察
  • 9.1 PCR扩增产物的电泳检测
  • 9.2 ITS区序列的分析
  • 9.3 形态学观察
  • 讨论
  • 1 虫草有性型及无性型关系的确证
  • 2 虫草无性型的分类的研究
  • 3 可能是同物异名的虫草的研究
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简介
  • 在读期间发表的学术论文

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