猕猴桃酒优良酵母的电融合法选育研究

论文摘要

猕猴桃是一种营养非常丰富的水果,堪称水果之王。我国是猕猴桃生产大国,但是我国猕猴桃的深加工产业还很落后,酿造猕猴桃酒是解决这一问题的有效途径。我国酿造猕猴桃酒的历史很长,但是目前缺乏专用酵母和配套的香气调控技术,很难适应现代国际市场的要求,制约着我国猕猴桃产业的进一步发展。本研究以实验室保藏的16株酵母为出发菌株,通过对其发酵力、降糖速度和产酸情况的测定,筛选出2株作为原生质体电融合的亲本菌株。接着通过对2株亲本的去壁酶量及酶解时间的研究确定最佳去壁条件,并采用双亲灭活法对亲本进行标记,确定了最适灭活条件。最后通过单因素实验和正交试验优化电融合条件,并以香气成分的GC-MS分析为主要指标,结合理化指标测定,通过模糊综合评判对融合子进行优选。论文的主要研究结果如下:（1）通过对16株保藏酵母菌株的CO2产生速率、降糖速度的考察,结合发酵过程酸度变化情况,确定WF58和WF65为下一步原生质体融合的两亲本。（2）通过吸光度OD600绘制的生长曲线确定两亲本的前培养时间均为6h;两亲本酶解曲线的变化趋势基本相同,通过酶解实验确定两亲本的最佳酶解条件均为:酶量16mg/ml,酶解时间60min。（3）在最优条件下制备原生质体并进行灭活实验,结果表明最佳灭活条件为:WF58 70℃水浴热灭活15min,WF65紫外灯30W50cm照射40min,均可以达到100%的灭活。（4）通过单因素实验和正交实验确定各个融合参数的最佳组合为脉冲场强为2100v/cm,脉冲时间是30μs,脉冲个数1个,脉冲间隔1.2s。影响力大小排序是脉冲场强、脉冲间隔,脉冲时间、脉冲个数。（5）通过杜氏管发酵实验初步筛选了19株酵母作为进一步筛选的供试菌种,并通过对这19株供试菌种和两亲本体积的测定结合DNA含量的测定和电镜观察鉴定出7株酵母为融合子。（6）以鉴定的7株融合子和两亲本进行酿酒实验,结束后分别对其进行理化指标测定和香气成分分析,结果显示各酒样的优劣顺序为:#2 >#1 >#3 >#4 >#7 >#9（WF65） >#6 >#8（WF58） >#5,最佳酵母菌株为#2酒样菌种,即2号酵母融合子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 猕猴桃的营养价值及生产概况
• 1.1.1 猕猴桃简介
• 1.1.2 猕猴桃的食用和药用价值
• 1.1.3 猕猴桃的生产概况
• 1.2 猕猴桃酒概述
• 1.2.1 猕猴桃加工概述
• 1.2.2 猕猴桃酒概述
• 1.3 猕猴桃酒用酵母的选育
• 1.3.1 现代酵母育种方法概述
• 1.3.2 现代酵母育种方向概述
• 1.4 原生质体融合技术概述
• 1.4.1 原生质体融合技术及其现状
• 1.4.2 原生质体融合技术的步骤和方法
• 1.4.2.1 原生质体制备的步骤和方法
• 1.4.2.2 原生质体融合的步骤和方法
• 1.4.2.3 原生质体的再生及融合子的检出和鉴定
• 1.5 猕猴桃酒香气成分研究综述
• 1.5.1 猕猴桃酒香气成分概述
• 1.5.2 猕猴桃酒香气成分的富集和分析方法概述
• 1.6 本研究的目的、意义和技术路线
• 1.6.1 本研究的目的、意义
• 1.6.2 本研究的技术路线
• 第二章 融合亲本的筛选
• 2.1 材料与仪器设备
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 原料
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器与设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 猕猴桃汁的制备
• 2.2.2 种子液的制备
• 2.2.3 出发菌株发酵力测定
• 2.2.4 出发菌株耗糖速率的测定
• 2.2.5 发酵过程酸度变化的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 出发菌株发酵力测定结果
• 2.3.2 出发菌株耗糖速率的测定结果
• 2.3.3 发酵过程酸度变化的测定结果
• 2.4 小结
• 第三章 亲本原生质体制备及再生条件研究
• 3.1 材料与仪器设备
• 3.1.1 供试菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂及配制方法
• 3.1.4 主要仪器与设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 双亲本出发菌株前培养时间的确定
• 3.2.2 双亲本原生质体制备及再生条件的确定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 双亲本出发菌株前培养时间确定结果
• 3.3.2 双亲本原生质体制备及再生条件的确定结果
• 3.4 小结
• 第四章 原生质体电融合条件优化研究
• 4.1 材料与仪器设备
• 4.1.1 供试菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂及配制方法
• 4.1.4 主要仪器与设备
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 双亲本原生质体的制备
• 4.2.2 双亲本原生质体灭活条件的确定
• 4.2.3 双亲本原生质体电融合条件的确定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 双亲本原生质体灭活条件结果
• 4.3.2 双亲本原生质体电融合条件确定结果
• 4.4 小结
• 第五章 融合子的鉴定及酿酒实验
• 5.1 材料与仪器设备
• 5.1.1 供试菌种
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 主要试剂及配制方法
• 5.1.4 主要仪器与设备
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 双亲本原生质体的制备
• 5.2.2 双亲本原生质体的灭活和融合
• 5.2.3 融合子的鉴定
• 5.2.4 融合子的酿酒实验
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 融合子鉴定实验结果
• 5.3.2 酿酒实验结果
• 5.4 小结
• 第六章 结论与讨论
• 6.1 结论
• 6.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介