蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞生长的影响及其与细胞周期和Bcl-2家族关系的实验研究

论文摘要

植物雌激素（PE）为一系列来自植物的非甾体类复合物,存在于大部分植物、水果和蔬菜中,PE的结构和甾体类激素相似,可与体内的雌激素受体结合,但其活性较人类雌激素弱102～105倍,有雌激素和抗雌激素双重效应。大量研究表明,绝经期或卵巢切除术后妇女应用雌激素替代治疗（estrogen replacement therapy, ERT ）可明显减轻妇女绝经期症状、预防骨质疏松和心血管疾病发病率。但长期应用雌激素易产生高血凝状态、高血压、水肿等副反应,并增加乳腺癌及子宫内膜癌的发病危险。为此,人们在致力于寻求雌激素替代物中,发现植物雌激素可减轻绝经期症状却不具有上述雌激素的副反应。目的:本实验室长期致力于植物雌激素方面的研究,并取得一定的进展。本课题组研究蛇床子素、白藜芦醇体外活性及其植物雌激素样作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法:1 MTT法和SRB法检测蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞增殖/抑制作用以及对其它肿瘤细胞的活性取经无酚红RMPI1640（内含5%CDT-FBS）培养的对数生长期细胞培养于96孔培养板内,培养24h后,加入不同浓度的蛇床子素、白藜芦醇,48h后MTT法和SRB法测定蛇床子素、白藜芦醇在体外对MCF-7细胞增殖/抑制率以及对其它肿瘤细胞的生长抑制率IC50或GI50。用MTT法检测蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞生长曲线的影响。2倒置光显微镜、荧光显微镜观察蛇床子素、白藜芦醇作用后MCF-7细胞形态结构改变。在对数生长期细胞中加入不同浓度蛇床子素、白藜芦醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L),作用于MCF-7细胞48h ,Giemsa染色后倒置光显微镜观察照相并保留结果。同法进行Hoechst33342染色,以紫外光（340nm）激发Hoechst,荧光显微镜观察照相并保留结果。3琼脂糖凝胶电泳分析蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞染色体DNA断裂的影响。在对数生长期MCF-7细胞,加入不同浓度蛇床子素、白藜芦醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用48h后抽提样本DNA,于1.5%琼脂糖胶电泳,电泳完成后用紫外光下观察并照相。4流式细胞术分析蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞凋亡率、增殖指数的检测以及对细胞周期的影响。取经无酚红RMPI1640（内含5%CDT-FBS）培养的对数生长期MCF-7细胞,加入不同浓度的蛇床子素、白藜芦醇,用流式细胞仪检测不同浓度的蛇床子素、白藜芦醇作用24 h、48 h后对细胞的影响。5免疫组化SP法检测蛇床子素( 0.8×10-7mol/L～3.2×10-7mol/L)、白藜芦醇(0.5×10-7mol/L～2.0×10-7mol/L)作用MCF-7细胞48h后对增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。6 RT-PCR法检测不同浓度蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞PCNA、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响。7 Western-blot法检测不同浓度蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞P21、Caspase-3、CDK2蛋白表达的影响。结果:1蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞增殖/抑制作用本课题通过体外MTT法发现低浓度的蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞有促增殖作用,其最高增值浓度分别为1.6×10-7mol/L、1.0×10-7 mol/L;而高浓度则对MCF-7细胞表现为抑制作用,其IC50分别为7.47×10-5mol/L、8.70×10-5mol/L。在不同浓度的蛇床子素、白藜芦醇作用下,通过观察对MCF-7细胞生长曲线的影响,发现其增殖/抑制活性具有量效关系。此外通过MTT法和SRB法还检测出高浓度的蛇床子素、白藜芦醇对多种肿瘤细胞都有抑制作用。2蛇床子素、白藜芦醇不同浓度组对MCF-7细胞周期的影响本文采用流式细胞仪分别检测不同浓度组的蛇床子素、白藜芦醇作用24h和48h后对MCF-7细胞的影响。结果显示与空白对照组相比较,蛇床子素、白藜芦醇低浓度组均可使MCF-7细胞G2+S期DNA含量比例明显增多,蛇床子素高浓度组使细胞周期阻断在S期;白藜芦醇高浓度组使细胞周期阻断在G1期。3蛇床子素、白藜芦醇高浓度诱导MCF-7细胞的凋亡高浓度的蛇床子素、白藜芦醇( 0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用于MCF-7细胞48小时,Giemsa染色后显微镜观察,可见细胞核形态呈现细胞凋亡的典型特征:核膜皱缩,核固缩,核碎裂;用荧光染料Hoechst 33342对细胞进行染色,在紫外光激发下发蓝色荧光,荧光显微镜下观察可发现MCF-7细胞凋亡的形态学变化。并且随着蛇床子素、白藜芦醇浓度的增加,细胞凋亡形态的变化愈显著,凋亡细胞的比例逐渐增多,具有剂量依赖性。在经典的DNA降解断裂检测实验中,经不同浓度的蛇床子素、白藜芦醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用于MCF-7细胞48小时后,抽提富集小分子量DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现典型的“DNA梯子”（DNA ladder）。通过流式细胞仪对细胞的DNA含量进行测定,可见经不同浓度的蛇床子素、白藜芦醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用于MCF-7细胞48小时后,对细胞DNA进行PI荧光染色,于正常G0/G1细胞群前出现DNA低染细胞群,称为“A0细胞群”或“亚G1细胞群,Sub- G1”即凋亡细胞群,该现象被认为是细胞发生凋亡的标志之一,且凋亡细胞的比例随着蛇床子素、白藜芦醇浓度的升高而增大,呈一定的剂量依赖性。综上结果可以认为蛇床子素、白藜芦醇高浓度作用于MCF-7细胞时能够诱导细胞的凋亡。4蛇床子素、白藜芦醇低浓度促进MCF-7细胞的增殖本文采用免疫组化SP法检测蛇床子素(0.8×10-7mol/L～3.2×10-7mol/L)、白藜芦醇(0.5×10-7mol/L～2.0×10-7mol/L)作用MCF-7细胞48小时后对增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。结果显示PCNA阳性颗粒位于胞核, PCNA表达的阳性率,蛇床子素1.6×10-7mol/L作用组为0.245,白藜芦醇1.0×10-7mol/L组为0.272,对照组为0.087（P<0.05）。说明作用组和对照组MCF-7细胞PCNA表达的阳性率之间存在显著性差异,作用组MCF-7细胞PCNA表达较对照组显著增加。5蛇床子素、白藜芦醇对细胞增殖/凋亡相关基因PCNA、Bcl-2和Bax的mRNA表达的影响本文观察了蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞相关基因PCNA、Bcl-2和Bax的mRNA表达的影响。RT-PCR结果显示高浓度(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)蛇床子素、白藜芦醇能增加MCF-7细胞中Bax的mRNA的表达,同时降低了PCNA和Bcl-2的mRNA的表达,与对照组相比均有显著性差异。而低浓度组增加PCNA、Bcl-2的mRNA表达,降低Bax的mRNA的表达,且与对照组相比均有显著性差异。提示低浓度蛇床子素、白藜芦醇通过上调PCNA和Bcl-2 mRNA的表达,协同下调凋亡基因Bax的表达,从而促进MCF-7细胞增殖。其诱导细胞凋亡作用则是通过上调Bax的mRNA,下调PCNA和Bcl-2 mRNA的表达来实现的。6蛇床子素、白藜芦醇对凋亡相关蛋白P21、Caspase-3及周期相关蛋白CDK2表达的影响本文观察了蛇床子素、白藜芦醇对细胞Caspase-3、P21及CDK2的蛋白表达的影响。经不同浓度的蛇床子素、白藜芦醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用于MCF-7细胞48h,Western-blot结果显示高浓度的蛇床子素、白藜芦醇可上调P21、Caspase-3蛋白表达,下调CDK2蛋白表达,且呈一定的剂量依赖性。结论:蛇床子素、白藜芦醇的高浓度和低浓度组对MCF-7细胞分别表现为两种不同的作用:高浓度抑制细胞生长;低浓度对细胞具有促增殖作用。低浓度作用组使细胞S+G2M期比例增加;蛇床子素高浓度组可将细胞阻断在S期,白藜芦醇高浓度组则将细胞阻断在G1期。同时蛇床子素、白藜芦醇还影响细胞内相关增殖基因、癌基因PCNA、Bcl-2与Bax mRNA,P21、Caspase-3基因蛋白,以及周期相关蛋白CDK2的表达,从而影响MCF-7细胞的增殖与凋亡。因此蛇床子素、白藜芦醇有明显的植物雌激素特性,对进一步开发利用,作为新型临床用药具有巨大的潜力。

论文目录

• 中文摘要
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• 研究论文 蛇床子素、白藜芦醇对MCF-7细胞生长的影响及其与细胞周期和Bcl-2家族关系的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历