猪瘟病毒P80基因的真核表达及p80蛋白对PK-15细胞致病变作用的研究

论文摘要

利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术,从猪瘟病毒Shimen株细胞毒中克隆出P80 基因,并进一步把P80 基因连接在真核表达载体pEGFP-C1 上,成功地构建出P80 基因重组真核表达质粒（pEGFP-P80）,为在哺乳动物细胞中表达并纯化出p80 蛋白奠定了基础。接着,把构建好的重组质粒pEGFP-P80 在PK-15 细胞中进行表达来研究p80 蛋白对PK-15 细胞的致病变作用,为研究p80 蛋白与猪源细胞发生CPE 效应之间的联系进行了探讨。1.参考已经发表的猪瘟病毒Alfort 株和Brescia 株的全基因组序列,设计2 对引物P1/P2 和B1/B2,在B1 和B2 的5’ 端分别引入Xho I 和Apa I 酶切位点,使用RNA 一步提取试剂盒,利用RT-PCR 和nPCR技术,成功地从猪瘟Shimen株细胞毒中扩增出约2.0kb 大小的P80 基因。将PCR 产物分离、纯化并与克隆载体pMD 18-T 连接,然后进行核苷酸序列测定和PCR、Bamh I /Hind Ⅲ双酶切的鉴定,结果表明其为P80 基因的重组质粒（pMD-P80）。将pMD-P80 分别经Xho I 和Apa I 双酶切和回收,然后与经过Xho I 和Apa I 酶解的真核表达载体pEGPF-C1 连接、转化,获得重组质粒,经PCR,Xho I 和Apa I 限制性酶切和序列测定,鉴定为真核表达质粒pEGFP-P80,并且目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确,为在哺乳动物细胞中表达并分离纯化p80 蛋白奠定了基础。2.利用阳性脂质体L2000 介导,在六孔细胞培养板中,将已经构建好的pEGFP-P80重组表达质粒转染到PK-15 细胞中进行表达。在转染后6h,利用荧光显微镜监测到发出绿色荧光的融合蛋白;在转染后24h,利用免疫组化SABC 法检测到目的蛋白p80。结果表明,重组表达质粒pEGFP-P80 可以在PK-15 细胞中表达出有免疫活性的p80 蛋白。重复转染操作,在96 孔细胞培养板中,将pEGFP-P80 重组表达质粒和空质粒pEGFP-C1 分别转染到PK-15 细胞中进行表达。分别在转染后24h、48h 对转染了pEGFP-P80 质粒的细胞组和转染了空质粒pEGFP-C1 的细胞组进行MTT 比色,测定OD值,并进行两组细胞活性分析。结果表明,利用pEGFP-P80 重组表达质粒在PK-15 细胞中表达出的p80 蛋白未对宿主细胞有明显的致病变作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 猪瘟及猪瘟病毒研究进展
• 1.1 猪瘟研究进展
• 1.1.1 猪瘟的流行与分布
• 1.1.2 猪瘟的临床症状
• 1.1.3 猪瘟的诊断
• 1.1.4 猪瘟病毒粒子结构、形态及理化特性
• 1.1.5 CSFV 的侵入及其在宿主体内的分布
• 1.1.6 CSFV 在宿主细胞中的繁殖过程
• 1.2 猪瘟病毒分子生物学研究进展
• 1.2.1 CSFV 的基因组结构和全序列研究概述
• 1.2.1.1 CSFV 的基因组结构
• 1.2.1.2 CSFV 基因组全序列研究进展
• 1.3.1 CSFV 基因组编码的蛋白质及其功能
• 1.3.1.1 猪瘟病毒的结构蛋白及其功能
• 1.3.1.2 非结构蛋白及功能
• 1.4.1 CSFV 基因组内部的缺失、重组与感染CSFV 细胞出现CPE 的关系
• 1.5.1 NS3 基因在病毒的复制及病毒与宿主细胞关系中的作用
• 1.6 猪瘟病毒的分子免疫学研究进展
• 1.6.1 囊膜结构糖蛋白E2 和E0 是CSFV 的主要保护性抗原
• 1.6.2 猪瘟的防制策略与防制新技术的研究
• 第二章 猪瘟Shimen株P80 基因真核表达载体的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要工具酶和试剂及各种细胞培养基
• 2.1.2.1 工具酶和试剂
• 2.1.2.2 细胞培养用试剂
• 2.1.2.3 细胞消化用试剂 ATV（Antibiotic trypsin versen）使用液
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 DNA 操作中其他主要试剂
• 2.1.4.1 LB 培养基
• 2.1.4.2 溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
• 2.1.4.3 饱和平衡酚（pH8.0）/氯仿/异戊醇（V/V/V 25:24:1）
• 2.1.4.4 TE 缓冲液
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 目的片段的扩增与回收
• 2.2.1.1 CSFV 总RNA 的提取
• 2.2.1.2 引物的设计与合成
• 2.2.1.3 RT-PCR 及nPCR扩增
• 2.2.1.4 PCR 产物的回收
• 2.2.2 目的基因的克隆
• 2.2.2.1 PCR 产物与pMD18-T 载体载体的连接
• 2.2.2.2 感受态细胞的制备
• 2.2.2.3 连接产物的转化
• 2.2.3 重组质粒的提取与鉴定
• 2.2.3.1 重组质粒的提取
• 2.2.3.2 重组质粒的鉴定
• 2.2.4 重组表达载体的构建与鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 RT-PCR 产物的电泳结果
• 2.3.2 目的片段的克隆与鉴定
• 2.3.2.1 重组质粒PCR 鉴定
• 2.3.2.2 重组质粒酶切鉴定
• 2.3.2.3 重组质粒的测序鉴定
• 2.3.3 重组表达质粒的鉴定
• 2.3.3.1 重组表达质粒的PCR 鉴定
• 2.3.3.2 重组表达质粒的酶切鉴定
• 2.3.3.4 重组表达质粒的测序鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 P80 基因的高度保守性
• 2.4.2 RNase 的存在与否及引物的设计是RT-PCR 成败的关键
• 2.4.3 nPCR 可增强反应的特异性和敏感性
• 2.4.4 哺乳动物细胞表达质粒PEGFP-C1 为本实验真核表达载体的优点
• 2.5 小结
• 第三章 P80 基因在PK-15 细胞中的表达及p80 蛋白对PK-15 细胞致病变作用的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 质粒与细胞
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器与设备
• 3.1.4 DNA 操作中其他有关主要试剂
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 质粒的克隆
• 3.2.2 P80 基因在PK-15 细胞中的表达
• 3.2.2.1 细胞转染前的准备
• 3.2.2.2 细胞转染
• 3.2.2.3 转染后的观察
• 3.2.3 表达蛋白的检测
• 3.2.4 p80 蛋白对宿主细胞PK-15 的致病变作用研究
• 3.2.4.1 于96 孔细胞培养板中转染细胞
• 3.2.4.2 四唑盐（MTT）比色和测定OD 值
• 3.3 结果
• 3.3.1 表达质粒表达产物的荧光鉴定
• 3.3.2 p80 蛋白的SABC 免疫组化染色结果
• 3.3.3 p80 蛋白对PK-15 细胞致病变作用的检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 影响脂质体介导的基因转染效率的因素
• 3.4.1.1 预实验找出阳性脂质体与DNA 的最佳用量比例
• 3.4.1.2 细胞的状态
• 3.4.1.3 血清
• 3.4.2 免疫组化SABC 法检测目的蛋白
• 3.4.3 p80 蛋白对PK-15 细胞的致病变作用
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介