导读:本文包含了非复制型腺病毒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:前列腺癌,腺病毒,hTERT,EZH2
非复制型腺病毒论文文献综述
许士高[1]（2019）在《hTERT及EZH2-shRNA双调控条件复制型腺病毒对前列腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响》一文中研究指出去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)较激素敏感性前列腺癌(hormone-sensitive prostate cancer,HSPC)治疗难度大,且预后较差,因此有必要开拓新的治疗方法,而基因疗法则是目前较为热门的治疗恶性肿瘤的方法,引起科研工作者的广泛关注。基因疗法是将目的基因以合适的载体导入到靶细胞中,修复相关的基因缺陷,达到治疗肿瘤的目的。本研究旨在构建一种受人端粒酶逆转录酶启动子(human telomerase catalytic subunit,hTERT)和 zeste 增强子同源物 2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)(以下简称EZH2-shRNA)双调控的条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAds,以下简称腺病毒),通过靶向抑制 CRPC细胞增殖及侵袭能力,从而实现安全、高效、稳定治疗CRPC的目的,为CRPC的精准基因治疗提供实验基础。目的:检测人前列腺组织中EZH2蛋白的表达水平。通过构建由hTERT和EZH2-shRNA双调控的腺病毒,探讨腺病毒对CRPC细胞增殖及侵袭能力的影响,为CRPC的精准基因治疗提供实验基础。方法:获取CRPC、良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)、HSPC患者的前列腺组织样本,采用免疫组织化学方法检测3组样本中EZH2蛋白的表达水平。构建一种由hTERT和EZH2-shRNA双调控的腺病毒,设计两条shRNA(即3hRNA1、shRNA2),用增殖实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测含两种不同shRNA的腺病毒对PC-3细胞增殖能力的干扰效果,筛选出干扰效果较好的shRNA进行后续实验。使用干扰效果较好的腺病毒去转染人肺腺癌A549细胞,通过镜下观察细胞被转染后的荧光图像,观察腺病毒是否构建成功。使用筛选出的腺病毒去转染PCa细胞(PC-3及DU145)。CCK-8实验及侵袭实验(Transwell)检测腺病毒转染前后PC-3和DU145细胞的增殖和侵袭能力。Western blot实验来检测腺病毒转染前后PC-3与DU145细胞中EZH2、CCND1、Ki-67及E-cadherin蛋白的表达。结果:1.免疫组化方法检测显示:与BPH患者标本相比,EZH2蛋白在HSPC和CRPC患者标本中表达明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,在不同类型的PCa标本中(CRPC与HSPC),对EZH2蛋白的表达量进行评分,EZH2评分较低部分中HSPC占比较大,而EZH2评分较高部分中则CRPC占比较大。两组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.基因测序证明单克隆抗体中shRNA及hTERT序列的正确性,表明单克隆载体构建成功。CCK-8法检测shRNA1和shRNA2对PC-3细胞增殖的干扰效果,结果显示,shRNA2抑制PC-3细胞增殖的效率更高。同时,我们使用携带EZH2-shRNA2及hTERT基因的腺病毒去干扰A549细胞,24 h、48 h、72 h后的荧光分析显示转染的细胞随时间逐渐增加,间接表明我们成功构建了腺病毒载体。3.Transwell侵袭实验结果表明,实验组(经腺病毒转染的细胞组)培养48 h后可显着抑制PCa细胞(PC-3和DU145)的侵袭能力,表明腺病毒对PCa细胞的侵袭能力具有显着抑制作用。实验组与对照组(未经腺病毒转染的细胞组)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.CCK-8结果显示,在PC-3及DU145细胞中,与未经转染的细胞相比,腺病毒转染PCa细胞后能显着抑制细胞的增殖能力(P<0.05)。5.Western blot结果显示,当EZH2蛋白的表达被抑制时,Ki-67及CCND1的表达也相应下降。相反,E-cadherin的表达增加。结论:1.EZH2蛋白在人前列腺癌组织中表达水平增高,且CRPC组织中EZH2蛋白较HSPC中表达上调明显。2.比较免疫组化检测中EZH2蛋白强度评分,EZH2蛋白在HSPC与CRPC组织中表达差异明显。3.成功的构建了能够在PCa细胞中稳定表达的CRAds。4.hTERT及EZH2-shRNA双调控的CRAds能够抑制人PCa细胞的增殖及侵袭能力,表现出显着的抗肿瘤作用。5.EZH2蛋白表达水平下调引起Ki-67、CCND1蛋白表达水平下调,同时E-cadherin蛋白表达水平上调。(本文来源于《扬州大学》期刊2019-04-05）
王晓雪,刘延珂,杨东东,吴艳阳,高冬生[2]（2018）在《表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究》一文中研究指出为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp~1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2018年02期）
王秋丽[3]（2018）在《携带自杀基因Dm-dNK和CD40L的选择复制型腺病毒对乳腺癌杀伤作用的研究》一文中研究指出目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,死亡率继肺癌之后,位列女性恶性肿瘤死亡率第二。根据美国癌症协会最新统计数据,1989年至2015年间,死亡率下降了39%,322600美国乳腺癌女性的命运被扭转,这得益于诊疗方法的提高(例如辅助化疗、内分泌治疗、靶向治疗等)和乳腺疾病的早期筛查。过去的20多年间,在遗传性疾病、恶性肿瘤、慢性感染性疾病等多领域展开了基因治疗的相关实验,一些基于基因治疗的I期、II期临床试验报道了严重的血液、免疫、神经系统遗传性疾病中基因治疗的显着疗效。自杀基因Dm-dNK编码的果蝇多底物脱氧核苷酸激酶具有广泛的底物特异性,能有效催化自然界所有的脱氧核糖核酸的磷酸化反应,催化效率比一般的核苷酸激酶高10-100倍,已有研究证实其作为自杀基因联合癌前药物在多种恶性肿瘤细胞的有效作用,不仅能直接杀伤肿瘤细胞,还能通过旁观者效应间接杀伤,同时有效提高对化疗药物的敏感性。乳腺癌、肠癌、肝癌等多种癌细胞表面均表达CD40,已有研究证明CD40-CD40配体(CD40 ligand,CD40L)交互作用能增强免疫应答,诱导抗原呈递细胞的活化,还可通过诱导癌细胞凋亡直接抑制肿瘤生长。溶瘤病毒疗法也是恶性肿瘤的基因治疗策略之一,其不仅作为基因治疗携带目的基因的载体,亦可通过病毒复制直接裂解、诱导体内抗肿瘤免疫应答等多重机制杀死肿瘤细胞。因此,本研究旨在构建携带自杀基因Dm-dNK和CD40L的溶瘤腺病毒,评估该系统对乳腺癌细胞体内及体外杀伤效果和作用机制,为乳腺癌治疗提供新的思路和方法。方法:一、细胞培养乳腺癌细胞系MDA-MB-231,MCF7,人正常胚肺成纤维细胞MRC5,人肾上皮细胞系HEK293细胞均由中国医科大学肿瘤研究所一室提供,使用含10%胎牛血清的DMEM培养基,100U/ml青霉素,100ug/ml链霉素,37℃5%CO_2培养。二、腺病毒载体的构建及验证,感染率的测定委托上海白泽公司构建P74-dNK,P74-CD40L,P74-dNK-CD40L及含绿色荧光蛋白的腺病毒Ad-GFP。RT-PCR验证目的基因Dm-dNK、CD40L的转录,western blot验证蛋白水平的表达。Ad-GFP检测相同条件下不同细胞系感染率的差别。叁、酶活性测定MDA-MB-231,MCF7,MRC5感染野生型腺病毒(adenovirus wild-type,Ad-WT),P74-dNK,P74-dNK-CD40L,用放射性[~3H]标记作为底物的核苷酸药物,放射活性用闪烁仪测定。四、溶瘤腺病毒瘤裂解作用的评估取对数生长期的MDA-MB-231及MRC5细胞感染Ad-WT、P74-dNK、P74-CD40L、P74-dNK-CD40L(MOI=0和1),4h后弃去含病毒的培养液,加入含10%FBS的DMEM培养基继续培养48h后,于倒置显微镜下观察瘤裂解作用。所有的细胞和上清液在感染后24小时收集,叁周期冷冻和解冻循环后获得细胞裂解产物。腺病毒滴度用HEK293细胞通过TCID50(tissue culture infectious dose)方法测定。MTT实验定量检测不同细胞系感染P74,P74-dNK,Ad-WT瘤裂解作用。五、携带基因Dm-dNK或CD40L的溶瘤腺病毒细胞杀伤作用的评估MTT实验检测不同细胞系感染P74-dNK联合核苷酸类似物溴乙烯脱氧尿苷(bromovinyl deoxyuridine,BVDU)肿瘤细胞杀伤作用,MTT检测不同细胞系感染P74-CD40L肿瘤杀伤作用。六、共同表达Dm-dNK和CD40L的溶瘤腺病毒细胞杀伤作用的评估及机制探索MTT实验检测不同细胞系感染P74-dNK-CD40L联合癌前药物BVDU肿瘤杀伤作用,评估随病毒和癌前药物浓度变化,细胞杀伤作用的变化。流式细胞检测技术检测不同细胞系感染不同组病毒凋亡率是否存在差异。旁观者效应实验检测P74-dNK-CD40L联合BVDU对肿瘤细胞的旁观者效应。七、评估共同表达Dm-dNK和CD40L的溶瘤腺病毒加入癌前药物后病毒复制情况利用HEK293细胞通过TCID50方法检测不同细胞系感染Ad-WT,P74-dNK,P74-CD40L,P74-dNK-CD40L加入癌前药物BVDU前后病毒滴度变化。八、裸鼠移植瘤实验评估共同表达Dm-dNK和CD40L的溶瘤腺病毒联合BVDU的体内杀伤作用36只BALB/C裸鼠,右侧腋下接种MDA-MB-231乳腺癌细胞系,分为4组:PBS,P74,P74-CD40L+BVDU,P74-dNK-CD40L+BVDU组,当肿瘤生长至约90mm~3时,腺病毒治疗组中的所有小鼠以48h为间隔3次瘤内注射共10~9pfu腺病毒,病毒注射后2-8天,以5mg/kg注射BVDU 2次(BVDU组与病毒注射同时注射)。每隔5天游标卡尺测量肿瘤长径和短径。肿瘤体积(mm~3)=1/2长度(mm)×宽度(mm)~2。结果:一、成功构建选择复制型腺病毒载体质粒P74-dNK-CD40L通过基因操作方法将Dm-dNK插入敲除E1B,hTERT启动子后多克隆位点,E3区域敲除,插入CD40L基因,构建P74-dNK,P74-CD40L,P74-dNK-CD40L。Ad-GFP感染感染各细胞系,MDA-MB-231,MCF7,MRC5表现出相似的转染率。二、目的基因的表达及酶活性的检测RT-PCR验证各病毒组目的基因RNA水平的转录,western blot验证蛋白水平目的基因的表达,正常细胞系感染溶瘤腺病毒E1A蛋白水平表达明显低于Ad-WT,表明溶瘤腺病毒在正常细胞系中复制缺陷。MDA-MB-231,MCF7感染重组腺病毒P74-dNK,P74-dNK-CD40L后的激酶活性是野生型的约100倍,MRC5中各激酶活性均较低。叁、溶瘤腺病毒在乳腺癌细胞系中的瘤裂解作用乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF7和MRC5感染Ad-WT及各溶瘤病毒组,乳腺癌细胞系在各病毒组均表现较强的瘤裂解作用,而MRC5中除Ad-WT外,溶瘤腺病毒各组均未表现明显瘤裂解作用,与细胞系中病毒复制情况一致。这与乳腺癌细胞系中TERT阳性表达,正常细胞系中TERT阴性,而我们构建的溶瘤腺病毒含hTERT启动子相关。四、Dm-dNK联合BVDU对乳腺癌细胞杀伤作用,CD40L对CD40阳性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞杀伤作用Dm-dNK联合BVDU对乳腺癌细胞系呈现明显的细胞杀伤作用,而对正常细胞无明显杀伤作用。溶瘤腺病毒携带的CD40L仅对CD40阳性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231呈现明显的杀伤作用。五、共表达Dm-dNK和CD40L基因的溶瘤腺病毒联合BVDU对乳腺癌细胞显着的杀伤作用,其通过诱导凋亡和旁观者效应发挥作用。P74-dNK-CD40L联合BVDU在MDA-MB-231中呈现最明显的细胞杀伤作用,更低的病毒滴度和癌前药物浓度即可发挥显着的细胞杀伤作用,且随病毒滴度和BVDU浓度增加,杀伤作用逐渐增强。在正常细胞系中,无明显杀伤作用。MDA-MB-231中P74-dNK-CD40L联合BVDU凋亡率明显优于其他病毒感染组,且在病毒滴度MOI≥1时,呈现明显的旁观者效应。六、BVDU抑制携带目的基因Dm-dNK和CD40L的溶瘤腺病毒复制乳腺癌细胞系MDA-MB-231感染P74-dNK,P74-dNK-CD40L组加入BVDU后,病毒复制明显减弱。在MDA-MB-231感染其他病毒组及MRC5各病毒感染组加入BVDU前后病毒复制无明显变化。七、携带自杀基因Dm-dNK和CD40L的溶瘤腺病毒联合BVDU对裸鼠移植瘤的抑制作用PBS组裸鼠移植瘤体积明显增大,P74-CD40L尤其是P74-dNK-CD40L联合BVDU组肿瘤增长抑制最明显。体内杀伤作用与体外实验相吻合。结论:我们成功构建了含Dm-dNK和CD40L基因的E1B缺失,含hTERT启动子的选择复制型腺病毒,证实该系统仅在乳腺癌细胞系中复制,且激酶活性是普通激酶的100倍左右。此外,本系统集瘤裂解、自杀基因杀伤作用、CD40-CD40L交互引起的细胞抑制作用为一体,对乳腺癌细胞杀伤作用显着,尤其对CD40阳性的MDA-MB-231细胞,因在正常细胞系中复制不佳,对正常细胞无明显杀伤作用。并证实其通过诱导凋亡和旁观者效应发挥效能。同时癌前药物BVDU的加入不仅对增强对癌细胞的杀伤作用,同时抑制病毒复制,有效防止了病毒的过度感染和播散,使得本系统在安全性方面亦是可行的,为乳腺癌基因治疗提供了新的思路和策略。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-02-01）
王晓雪[4]（2017）在《表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究》一文中研究指出猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种猪的急性、高度传染性肠道疾病,以感染猪呕吐、水样腹泻、脱水,以及仔猪的高死亡率为主要特征,各种年龄段猪均易感。PED于1984年在中国被首次确认,之后随着二联灭活苗或弱毒苗的使用使疫情基本保持稳定。2010年10月以来,由PEDV变异株导致的PED再次暴发,对我国的养猪业造成了巨大的损失。PEDV变异株与经典疫苗株的差别主要集中在纤突(S)蛋白的N端,基于经典毒株的灭活苗和弱毒苗不能为猪群提供足够的免疫力来对抗PEDV变异株的感染。抗PEDV免疫主要以黏膜免疫为主,目前PEDV变异株的高效培养还存在一定的难度,因此,探索各种途径研制出能够诱导黏膜免疫的针对PEDV中国变异株的新型高效疫苗势在必行。腺病毒载体具有感染细胞范围广,能有效刺激机体产生体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫应答等优势,已被广泛应用于人和动物的基因治疗和疫苗研发。复制型人腺病毒血清4型(human adenovirus serotype 4,HAd V-4)疫苗株已经在防控人类急性呼吸道疾病领域应用多年,并被证明是安全有效的,它能够模拟天然病毒感染宿主细胞,刺激机体产生包括黏膜免疫的各级免疫反应。本研究中首次尝试以复制型HAd V-4疫苗株为载体,构建了重组基于HAd V-4疫苗株的病毒载体系统,并将PEDV中国变异株S蛋白(N端1~380aa)基因插入HAd V-4基因组中,构建出能够表达PEDV中国变异株S蛋白的重组腺病毒,并对重组病毒的免疫原性进行了初步研究,以期为研制抗PEDV高效疫苗提供思路和为更有效防控猪流行性腹泻提供备选新工具。本论文研究内容分为以下叁个部分:1.复制型人腺病毒血清4型载体系统的构建及重组病毒在猪源细胞系上生长特性研究本试验构建了基于HAd V-4疫苗株的复制型重组HAd V-4载体系统,该系统包含病毒基因组骨架载体p Ad4FAST以及穿梭载体p Ad4FAST-shuttle,两载体在BJ5183宿主菌中同源重组后得到重组腺病毒感染性克隆,提取全长感染性克隆DNA,经Pac I酶切后转染293细胞,拯救出重组病毒。为验证该系统的可行性,以EGFP作为标记基因成功构建能够表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒r Ad4△E3-EGFP。将重组病毒r Ad4△E3-EGFP感染不同的猪源细胞系,均能观察到明显的细胞病变和绿色荧光。研究结果为利用HAd V-4疫苗株作为载体研发猪用疫苗提供了工具和理论依据。2.表达PEDV中国变异株S蛋白的复制型重组HAd V-4的构建及鉴定本试验选取PEDV变异株与经典疫苗株纤突(S)蛋白的差异区域(N端1~380aa)基因为靶基因,利用试验一中构建的HAd V-4载体系统,将该基因插入到HAd V-4基因组E3区构建重组HAd V-4感染性克隆,将感染性克隆转染293细胞后拯救出重组病毒r Ad4△E3-S。Western blot结果显示,重组病毒成功表达PEDV S蛋白,为进一步评价重组病毒的免疫原性提供了试验材料,也为PEDV活载体疫苗的研发奠定基础。3.表达PEDV中国变异株S蛋白的复制型重组病毒r Ad4△E3-S在小鼠体内免疫原性研究为研究所构建的表达PEDV中国变异株S蛋白的重组病毒的免疫原性,本研究选取小鼠作为动物模型,重组病毒首次免疫小鼠后,即能刺激小鼠产生抗PEDV S蛋白的抗体,再次免疫后,抗体水平显着上升并能维持较长时间。病毒中和试验结果显示,重组病毒r Ad4△E3-S免疫小鼠产生的抗S蛋白抗体对变异毒株CH/ZMDZY/11和疫苗株CV777均有中和作用,但对变异株的中和活性明显高于对经典疫苗株的中和活性。抗S蛋白抗体抑制变异毒株CH/ZMDZY/11感染Vero细胞的平均中和滴度为1:68,而抑制疫苗株CV777感染Vero细胞的平均抗体滴度只有1:8。利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测了免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,体外经S蛋白抗原刺激以后,重组病毒免疫组小鼠淋巴细胞的增殖活性显着高于空载体病毒免疫组和DMEM对照组。并且,重组病毒免疫组较其它试验组小鼠CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌PEDV S蛋白特异性IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平增高,提示重组病毒能刺激小鼠产生抗原特异性细胞免疫应答。试验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫原性奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供理论依据。(本文来源于《河南农业大学》期刊2017-06-01）
于雷,李永红,秦玺,杨靖清,饶春明[5]（2017）在《Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒》一文中研究指出目的:建立Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒(RCA)。方法:首先制备高纯度的pXC1质粒参考品(含有E1基因序列),紫外吸收法定量后经过数学换算得到拷贝数;然后比较染料法和探针法的灵敏度,建立适用的Q-PCR检测方法;最后用新建Q-PCR法定量测定腺病毒基因治疗产品中的RCA。结果:pXC1质粒参考品的拷贝数初步标定为2.6×1010拷贝/μL;探针法的灵敏度比染料法高1000倍;将pXC1质粒参考品应用于Q-PCR(探针法)测定腺病毒基因治疗产品中的RCA,标准曲线回归方程为y=-1.416ln(x)+47.395,R~2=0.9966,供试品的Cq值均位于标准曲线范围内。结论:新建Q-PCR法适用于检测腺病毒基因治疗产品中的RCA,且结果准确可靠。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2017年03期）
陈皓[6]（2017）在《间充质干细胞装载病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒在乳腺癌荷瘤鼠模型中的治疗研究》一文中研究指出肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。尽管传统治疗手段应用广泛,但因为缺乏肿瘤特异性,常会对正常细胞造成较大的毒副作用。经过基因工程改造的溶瘤腺病毒因其能够在肿瘤细胞中特异性扩增,故称为条件复制型腺病毒。尽管经过优化和改进的溶瘤腺病毒已经用于临床治疗,但依然存在一些缺点,如免疫原性高,肝脏毒性大,瘤内注射时病毒感染肿瘤的范围有限以及腺病毒复制的安全性问题等。克服上述溶瘤腺病毒缺点的一个方法是使用间充质干细胞来装载和投送腺病毒载体。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类非造血系统来源的成体多能干细胞,它可以从骨髓,脂肪组织,外周血,脐带血,骨,肌肉,软骨等多种组织中分离得到。在肿瘤基因治疗中,MSC因具有归巢性和免疫逃避等特点,常被用来作为投送治疗基因或者病毒载体的工具。当使用MSC作为溶瘤腺病毒的投送载体时,由于溶瘤腺病毒可以在MSC中进行复制,因此导致MSC的活力降低,如迁移与归巢的活力降低,最终影响MSC投送病毒的能力及基因治疗效果。所以使用MSC投送溶瘤腺病毒时,MSC的病毒装载量不能过大,需要与MSC的归巢活力保持平衡,即在不影响MSC迁移和归巢活力的情况下尽量增大病毒装载量,以获得最佳的基因治疗效果。构建一种病毒复制可以被调控的溶瘤腺病毒是解决这种平衡问题的关键。实施对溶瘤腺病毒复制的调控,可以控制病毒在MSC未到达肿瘤细胞之前不在细胞内复制,当MSC迁移到肿瘤组织后,再使病毒复制开启,这样可以在不影响MSC活力的情况下,获得最大的病毒装载量。该种方式可以精确控制病毒的释放,确保在MSC到达肿瘤组织之后释放病毒,进而避免病毒对正常组织和细胞的影响。使用MSC投送调控复制溶瘤腺病毒进行体内肿瘤治疗,可利用了 MSC的归巢和免疫逃避的优势,将病毒更加安全有效地投送至肿瘤组织区域,从而实现溶瘤腺病毒对肿瘤治疗安全性和有效性。实施对目的基因的表达调控,可以使人们对基因功能的研究和基于基因的疾病治疗变得更为细致精准。Tet调控系统因其安全有效被广泛地使用在基因功能研究和基因治疗领域。利用Tet调控系统调控溶瘤腺病毒在MSC中的复制,是控制腺病毒复制的一个有效策略。腺病毒的复制起始于病毒E1A基因的表达,若能使用Tet-on系统调控病毒E1A基因表达,就可以实现对MSC中溶瘤腺病毒复制的调控,该策略将对MSC装载溶瘤腺病毒的肿瘤基因治疗奠定重要基础。因此本研究基于以上的研究背景,从肿瘤治疗的安全性和有效性意义出发,构建一种病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒,并在体外测试该病毒的基础上,评估其在乳腺癌动物模型体内的治疗效果。为了完成上述的目标,本课题进行了实验研究并取得了以下结果。(1)病毒复制受rtTA介导的转录激活型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:本研究构建了 3种rtTA介导的Tet-on系统,并构建了使用此3种Tet-on系统调控病毒ElA基因表达的病毒载体,包装成病毒后在细胞内进行病毒的复制检测。研究结果显示,3种rtTA介导的Tet-on系统无法有效调控病毒复制。采用Luciferase报告基因对失控原因进行探索分析,结果显示,rtTA介导的激活型Tet-on系统调控病毒ElA基因表达时,会受到ElA基因自身蛋白产物及腺病毒的某种组份的干扰,导致病毒复制调控失效。研究证实激活型Tet-on系统控制病毒复制的策略可行性较差。(2)病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:构建了 TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控系统,及由该系统调控复制的条件复制型腺病毒载体,检测了病毒在细胞内的复制及hMSC装载病毒实验。研究结果显示,此类型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,关闭该病毒在hMSC中的复制,可以将hMSC对腺病毒装载量提升一个数量级。(3)hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的腺病毒在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤模型中的治疗研究:使用上述有效的复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒感染hMSC,利用hMSC投送该病毒对乳腺癌荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗研究。研究结果显示,装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。综上所述,本研究对不同类型的Tet-on系统调控腺病毒的复制进行了研究探索。提出了病毒复制受rtTA介导的激活型Tet-on系统调控的条件复制腺病毒复制失控的原因;首次构建了病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒载体,证实该病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,可以将hMSC对病毒装载量提升一个数量级;首次利用hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒对乳腺癌细胞荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗,结果显示装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。(本文来源于《陕西师范大学》期刊2017-05-01）
李鹏飞[7]（2017）在《复制型腺病毒介导的拟南芥激酶基因靶向分子治疗肺癌的研究》一文中研究指出目的:肺癌是目前中国和世界上最高发的恶性肿瘤之一,也是全球恶性肿瘤致死的首要因素。即使在根治手术后,依然存在转移、复发,预后不良的死亡风险。手术是目前治疗非小细胞肺癌的最佳治疗方案,但可以手术的患者又少之甚少,约占患病总数的20%-30%,绝大数患者在发现肺内病变时已失去了手术机会;化疗便成为了治疗非小细胞肺癌的重要治疗手段,但传统化疗药物缺乏靶向性,广泛的杀伤效应不止作用于肿瘤细胞,同时对正常细胞的杀伤作用也非常明显;毒副作用巨大,给患者带来了极大的痛苦。因此,将肺癌分子生物学等领域为研究基础的肺癌基因分子靶向研究作为重点,进而研究其病理生理发病机制及综合治疗方法成为肺癌研究的重要课题。本研究拟选定腺病毒介导的At-dNK(Multisubstrate Deoxyribo-nucleoside Kinase of Arabidopsis Thaliana)基因靶向分子治疗肺癌为研究内容。本实验观察自杀基因联合前药系统对肺癌细胞体内外的双重治疗作用,旨在为有效干预肺癌术后治疗建立一种新的分子治疗方式。方法:1、腺病毒质粒的构建,表达及酶活性的检测1.1腺病毒载体的构建及转染:根据At-dNK的cDNA,在其两端设计出带EcoRI和XhoI的酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(PCR)将At-dNK克隆到质粒载体pENTER12中,质粒pENTER12包含有CMV启动子,多克隆位点和SV40 poly A尾,pENTER12-dNK与质粒PPE3-RC利用内切酶LR重组,并与增殖型腺病毒质粒pZD55共转染至腺转录病毒包装细胞HEK293细胞,9-14天后出现病毒空斑,利用DNA提取试剂盒抽提重组后病毒的DNA,通过PCR验证后命名为ZD55-dNK。另外,将At-dNK的终止密码敲出,与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合成为dNK-GFP,使At-dNK的表达及转染率能够通过荧光来观察。复制缺陷5型腺病毒Ad-GFP用于比较不同细胞系间感染率的区别。1.2 At-dNK基因的表达及酶活性的检测:用TRIZOL方法提取纯化A-549,NCI-H520,549/dNK和520/dNK以及感染腺病毒ZD55-dNK后的肺癌细胞系A-549,NCI-H520,正常细胞系MRC-5,使用反转录PCR试剂盒对目的基因的表达进行检测。酶活性测定通过提取细胞的蛋白,用放射性[3H]标记作为底物的核苷酸药物,混合液在Whatman DE-81滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。2、At-dNK基因与核苷类似物联合体内体外对肿瘤细胞杀伤作用的研究2.1核苷类似物抑制ITCH对肺癌细胞的杀伤作用:核苷类似物经磷酸化后,可抑制DNA合成,使DNA链断裂,诱导p53依赖途径的细胞凋亡,通过调控Wnt/β-连环蛋白途径,抑制ITCH,ITCH表达的降低可以抑制肿瘤细胞的增殖亦可促进肿瘤细胞的凋亡;应用siRNA及siNC(阴性对照),转染肺癌细胞系,沉默ITCH,转染48小时后应用MTT法测定细胞增殖情况。采用V-FITC双染凋亡检测试剂盒观察细胞的凋亡情况及凋亡比例。各种细胞铺6孔板加入siRNA及siNC处理,经Annexin V-FITC和碘化丙锭双重染色后用流式细胞仪分析凋亡比例。2.2 At-dNK基因与核苷类似物联合对肺癌细胞的杀伤作用:稳定转染的细胞549/dNK和520/dNK及未转染的对照细胞A-549和NCI-H520铺板,加入不同浓度的ara-C,ara-T和CdA,共培养5天后采用MTT法检测细胞增殖情况。肺癌细胞系A-549,NCI-H520以及正常细胞系MRC-5铺板,培养基在第二天分别替换为病毒溶液ZD55-dNK,ZD55,DL1520,和WtAd,感染2天后,加入不同浓度的BVDU和ara-T,浓度为0,0.001,0.01,0.1,1,和10μM,共培养5天后采用MTT法检测细胞增殖情况。采用Annexin V-FITC双染凋亡检测试剂盒观察治疗后细胞凋亡情况及凋亡比例。各种细胞铺6孔板加入核苷类药物处理,经Annexin V-FITC和碘化丙锭双重染色后用流式细胞仪分析凋亡比例。2.3 At-dNK基因与核苷类似物联合对裸鼠移植瘤的抑制作用:采用100-150mm~3裸鼠皮下种植肿瘤模型,6-8周龄的BALB/C裸鼠皮下注射转染的549/dNK细胞和对照A-549细胞.治疗组包括10只:5只A-549转移瘤,5只549/dNK转移瘤;所有治疗组动物在成瘤注射6天后腹腔给药ara-T治疗一个月。对照组包括8只:4只A-549转移瘤,4只549/dNK转移瘤,对照组动物成瘤注射6天后腹腔给PBS或ara-T。治疗条件满足后,裸鼠处死剥离瘤体根据公式(a2×b)/2测量瘤体积(α为短径).549/dNK-EGFP转移瘤的裸鼠通过荧光体外成像观察At-dNK的表达。3、安全机制检测研究3.1重组腺病毒ZD55-dNK与BVDU联合对腺病毒的抑制作用:将对数生长期的肺癌细胞A-549正常成纤维细胞MRC-5铺24孔板过夜,以MOI=1的病毒ZD55-dNK,ZD55,DL1520和WtAd5感染细胞2天,加入1μM的BVDU或ara-T处理3天。分别收集不同病毒处理的细胞及培养基,反复冻融裂解细胞释放病毒。梯度稀释病毒溶液,利用肾成纤维细胞293通过TCID50(tissue culture infectious dose)方法检测病毒滴度在药物处理前后的变化。同样，细胞经过病毒及药物的干预方法如上,利用细胞裂解液提取细胞蛋白,通过Western Blot蛋白杂交法检测病毒早期转录单位蛋白E1A在治疗前后的变化。结果:1、病毒载体的构建:通过转染A-549细胞筛选出的549/dNKEGFP细胞发现融合At-dNK的荧光蛋白表达位置集中在细胞核。NCI-H520也是如此。提取腺病毒ZD55-dNK的DNA利用PCR来鉴定病毒是否正确构建,电泳证实CMV启动子长度为521bp,At-dNK序列长度为779bp。细胞系对病毒的感染率由表达绿色荧光蛋白的野生5型腺病毒(Ad5-GFP)来确定。结果肺癌细胞系A-549和NCI-H520较正常细胞系MRC-5表现出更高的感染率。2、At-dNK基因的表达及酶活性的检测:提取稳定转染细胞549/dNK和520/dNK及未转染细胞A-549和NCI-H520的mRNA,PCR及电泳后发现只有转染后的细胞有明显At-dNK的表达。溶瘤腺病毒ZD55-dNK感染的细胞中,肺癌细胞A-549和NCI-H520有明显At-dNK的表达而正常细胞MRC-5表达较低,可见腺病毒ZD55-dNK具有靶向性。稳定转染细胞549/dNK和520/dNK(3857.47 pmol/mg/min)蛋白活性明显高于A-549和NCI-H520(84.93 pmol/mg/min)。同样ara-C,ara-T和CdA在细胞549/dNK和520/dNK内的磷酸化程度也远远高于A-549和NCI-H520。这些结果证明了At-dNK基因能够在肺癌细胞内稳定发挥激酶活性。病毒ZD55-dNK感染后的肺癌细胞系A-549和NCI-H520蛋白活性明显高于没有感染病毒的空白细胞系,分别为25倍及50倍。病毒ZD55-dNK感染后正常细胞系MRC-5酶活性低于感染后癌细胞系的10倍。这些结果证明了腺病毒ZD55-dNK能够在肺癌细胞中选择性表达并稳定发挥激酶活性。3、核苷类似物对肺癌细胞的杀伤作用:经siRNA做沉默处理的ITCH的蛋白表达在H1975和Calu3细胞系中均显着受到抑制。H1975细胞和Calu3细胞中凋亡细胞的百分比分别为2.1%和1.9%。同时,两种细胞系中siRNA对照组的凋亡率均小于3%。然而,当用siITCH处理细胞时,凋亡细胞的数量(H1975细胞中43.2%,Calu3细胞中45.7%)显着增加(p=0.001)。这些结果表明siITCH有效促进了肺癌细胞的凋亡。4、At-dNK基因与核苷类似物联合对肺癌细胞的杀伤作用:两株表达At-dNK的细胞(549/dNK 520/dNK)表现出明显的药物敏感性,除了520/dNK细胞联合CdA。最敏感的是549/dNK细胞联合ara-T,在1-10μM ara-T的作用下仅有5%或更少的细胞存活率。而且,549/dNK和520/dNK细胞达到半数致死量所需ara-T的药物浓度比对照组所需药物剂量少了近800倍,其它核苷类似物底物敏感性较ara-T略弱。At-dNK/核苷类似物系统对肺癌细胞的杀伤作用是通过凋亡方式介导细胞死亡。549/dNK和520/dNK细胞在1μM剂量ara-T作用下,凋亡细胞比例分别为75%和58%,相反的,A-549和NCI-H520细胞在同剂量ara-T作用下,细胞凋亡比例为18%和22%。At-dNK/核苷类似物系统对肺癌细胞的杀伤作用是通过凋亡方式介导细胞死亡。溶瘤腺病毒ZD55-dNK联合BVDU能够更有效的杀伤肺癌细胞,与不携带自杀基因的另外叁种病毒相比,即使在极低的药物浓度作用下(0.01μM BVDU),杀伤作用依然明显;然而在正常细胞中,ZD55-dNK所感染的细胞无论加或不加药物,均表现出较其它叁种病毒更低的毒性,光镜下观察到的细胞病理效应(CPE)也证实了相同的结果,而且BVDU比ara-T对At-dNK的底物特异性更高。5、At-dNK基因与核苷类似物联合对裸鼠移植瘤的抑制作用:At-dNK/核苷类似物系统对转有At-dNK的肺癌细胞转移瘤549/dNK和520/dNK治疗后的体积为430±197 mm~3和1068±227 mm~3。而对照549/dNK转移瘤PBS处理组瘤体积为3325±506 mm~3。肿瘤生长曲线表明,A-549转移瘤ara-T处理组与A-549转移瘤PBS处理组,及549/dNK转移瘤PBS处理组,在瘤体生长速度上没有统计学差异(P>0.05所有观测时间点),然而549/dNK转移瘤ara-T处理组与以上几组相比,瘤体生长在治疗16-30天时明显被抑制(P<0.05)。6、腺病毒ZD55-dNK与BVDU联合可抑制腺病毒增殖:TCID50方法检测病毒ZD55-dNK,ZD55,DL1520及Wt Ad感染后的肺癌细胞系A-549和正常细胞系MRC-5,加入不同浓度化疗药物BVDU和ara-T,检测加药前后的细胞及上清病毒滴度变化,在肺癌细胞中,ZD55-dNK联合BVDU治疗病毒滴度下降最为明显,与其它病毒滴度相比,降低接近1000倍。Western Blot方法对病毒早期转录单位E1A的观察也证实了这一点,由于溶瘤病毒的选择性表达,ZD55-dNK感染后E1A仅在肺癌细胞中表达,ZD55-dNK联合BVDU使E1A表达明显降低,而ZD55或DL1520的E1A加药后变化不明显,而正常细胞中,除了野生型病毒在MRC-5中表达,溶瘤病毒的E1A条带显色不明显。结论:At-dNK激酶基因能够在肺癌细胞系A-549和NCI-H520中高水平表达,并保持蛋白激酶活性。持续磷酸化作为底物的多种核苷酸类似物dThd,ara-C,ara-T和CdA表现出广泛底物特异性及高催化率。我们构建的增殖型溶瘤腺病毒ZD55-dNK,能够使At-dNK特异性的在肺癌细胞系A-549和NCI-H520中高水平表达,并保持蛋白激酶活性。同时,溶瘤病毒的瘤裂解作用,配合At-dNK持续磷酸化作为底物的核苷酸类似物BVDU和ara-T,可通过凋亡方式导致肿瘤细胞死亡,对正常细胞影响甚微。另外,在腺病毒联合BVDU对肺癌细胞的治疗过程中,毒性产物BVDU-TP不仅对肺癌细胞有杀伤作用,对增殖病毒本身也有抑制作用,尽管机制尚不明确,但是这种协同抑制作用有效的防止了病毒的过度的感染和播散,为有效干预肺癌发生、发展及临床上腺病毒应用的安全性提供有力的实验基础。At-dNK/核苷类似物治疗体系可以作为一种新的自杀基因治疗方式,可为肺癌的诊疗提供崭新,高效的治疗手段。(本文来源于《中国医科大学》期刊2017-02-01）
李龙光,李书华,王红艳,龙捷,谢晓斌[8]（2015）在《CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用》一文中研究指出目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转染293细胞,产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增,扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定;real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达,筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞,检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒p DC316-CXCR4-GFP,与骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光;PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×1013PFU/L;CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比,CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异,第5天细胞凋亡率明显增加,细胞活性明显降低,各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP,该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2015年07期）
李慧昕,王玉龙,韩宗玺,刘胜旺[9]（2014）在《鸭瘟病毒作为非复制型疫苗载体的研究》一文中研究指出鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的以侵袭上呼吸道以及泌尿道为主的高度接触性传染病。该病的防控主要以疫苗免疫为主,由于IBV血清型众多,不同血清型弱毒疫苗交叉使用造成IBV重组。此外,由于母源抗体的干扰,弱毒疫苗通常不能及时产生免疫保护,而灭活疫苗产生抗体较慢,因此鸡只常存在免疫空白期,给IB防控带来困难。鸭瘟病毒为疱疹病毒科成员,主要感染雁形目禽类,不感染鸡,在鸡体内可一过性复制,具有作为非复制型病毒性疫苗载体的优势。本研究以鸭瘟病毒为载体,以本研究室构建的rDEV US10-EGFP为亲本病毒,构建表达鸡传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白N、纤突蛋白S以及纤突蛋白S1亚单位的重组鸭瘟病毒。经交叉PCR鉴定以及序列测定,表明IBVN、S和S1基因正确插入鸭瘟病毒基因组内部。Western blot以及间接免疫荧光试验表明,IBV N蛋白、S蛋白和S1蛋白均在鸭瘟病毒复制过程中得到了表达。将叁株重组病毒在鸡胚成纤维细胞上传代至20代,每5代进行PCR检测和间接免疫荧光试验检测,结果表明,IBV N、S和S1基因均随着鸭瘟病毒的传代而稳定遗传并能够稳定表达。对3株重组病毒一步生长曲线进行测定,结果表明3株重组病毒表现出相似的复制趋势,与亲本病毒rDEV US10-EGFP比较,其病毒复制滴度相近,生长曲线一致。将3株重组疫苗rDEV-N、rDEV--S和rDEV-S1免疫1月龄SPF白莱航鸡,并设对照组,分别于免疫后7d、21d和35d用IBV强毒株进行攻击。免疫后7d攻毒,各组死亡率分别为30%(rDEV-N)、10%(rDEV-S)、30%(rDEV-S1)和30%(control);免疫后21d攻毒,各组死亡率分别为30%(rDEV-N)、10%(rDEV-S)、30%(rDEV-S1)和40%(control);免疫后35d攻毒,各组死亡率分别为10%(rDEV-N)、20%(rDEV-S)、10%(rDEV-S1)和10%(control)。同时应用real-time PCR检测攻毒后5d、10d、15d和20d鸡只咽拭子排毒情况,从7d、21d和35d攻毒结果来看,rDEV-S组鸡只排毒比例少于其他2个免疫组;从攻毒时间来看,21d攻毒较7d和35d攻毒鸡只排毒比例少。由此得出结论,重组疫苗rDEV-S一次免疫能够对鸡只提供良好免疫保护,免疫后7d就能够保护90%鸡只抵抗强毒的攻击,免疫后21d鸡只受到IBV强毒攻击其排毒比例较少,说明鸡只获得了坚强的免疫保护。(本文来源于《第九届全国免疫学学术大会论文集》期刊2014-10-18）
王宏芳,吴嘉慧,刘纯岩,刘威武,孙延红[10]（2014）在《携带TRAIL基因的条件复制型腺病毒载体的构建及其辐射诱导表达》一文中研究指出目的:构建携带早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的条件复制型腺病毒载体pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,观察其联合2.0Gy X射线照射对人乳腺癌MDA-MB-231细胞TRAIL表达的影响。方法:以pMD18T-Egr1为模板,成功克隆Egr-1序列,将TRAIL基因置于下游,构建条件复制型腺病毒载体pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1BpE1B55K(CRAd.pEgr1-TRAIL),病毒包装后感染细胞,给予X线照射,利用Real time PCR法检测TRAIL mRNA表达水平,ELISA法检测TRAIL蛋白表达水平。实验设对照(control)组、2Gy组、空病毒(CRAd.p)组、CRAd.p+2Gy组、CRAd.p-Egr1-TRAIL组和CRAd.p-Egr1-TRAIL+2Gy组。结果:成功构建pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,并进行了病毒包装。以病毒滴度5感染复数(MOI)感染MDA-MB-231细胞24h后给予2.0Gy X射线照射,4h后MDA-MB-231各组细胞中TRAIL mRNA表达水平开始升高,8h后各组表达达峰值;CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组mRNA表达水平升高最为明显,约为对照组的160倍(P<0.01),随后表达水平逐渐下降;6h后各组MDA-MB-231细胞中TRAIL蛋白表达水平开始升高,24h后各组TRAIL蛋白表达水平达峰值,48h后TRAIL蛋白表达水平下降,但仍未降至正常水平;与其他各组比较,CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组TRAIL蛋白表达水平升高最明显(P<0.01)。结论:成功获得条件复制型腺病毒载体,联合2.0Gy X射线照射可使MDA-MB-231细胞中TRAIL mRNA和蛋白表达水平升高。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2014年04期）
非复制型腺病毒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp~1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
非复制型腺病毒论文参考文献
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