论文摘要
第一部分SMART技术平台的建立和HDAC抑制剂诱导凋亡新机制的探讨研究背景细胞凋亡是一种程序性细胞死亡的机制,生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程,是正常机体对生理或病理信号引发的自主性的细胞清除过程。而在肿瘤细胞内逃避细胞凋亡是肿瘤的一大标志,也是肿瘤治疗失败的主要原因之一。认识肿瘤凋亡途径的特异性调控方式是认识肿瘤,治疗肿瘤的必要手段。近年来开发出一大类HDAC抑制剂具有广泛的抗肿瘤效应,是发现肿瘤特异性分子靶点的良好切入点。运用Suppression of Mortality by Antisense Resuce Technique（SMART）技术,从HDAC抑制剂特异性诱导肿瘤细胞凋亡的角度入手,筛选出了一系列凋亡相关基因,认识肿瘤凋亡途径的特异性调控方式,能够为肿瘤的治疗提供新的科学依据和药物作用靶点。实验方法Trichostatin A诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡反义cDNA文库的构建和凋亡效应基因的筛选及鉴定Trichostatin A处理人乳腺癌MCF-7后,于不同时间点收集细胞。提取细胞的总RNA并且分离纯化mRNA并且逆转录成cDNA,将cDNA片段随机的插入到质粒pCEP4形成SMART文库,反义cDNA文库40μg转染HeLa细胞,空载体作为对照。转染48h后,Trichostatin A （150nmol/L）与HYB（200ug/L）的联合筛选12d后,检查存活的细胞克隆插入的基因。结果经过MTT比色法,及流式细胞术检测证实250nmol/L TrichostatinA能诱导人MCF-7和HeLa细胞的凋亡,并使用TRIZOL提取处于凋亡不同时期的MCF-7细胞总mRNA。提取mRNA逆转录后得到的反义cDNA文库片段插入率大于90%,片段平均长度约为1.5kb,库容约为2×105；将此文库质粒DNA转染HeLa细胞,经过筛选得到阳性克隆后,Hirt DNA提取转化,经酶切测序获得76个EST片度。所获得片段进行生物信息学分析后,选取若干基因开展后续工作,对其中的C20orf108,Liv-1和Ubiquitin B进行了详细的机制研究。结论1.建立HDAC抑制剂TrichostatinA诱导肿瘤细胞凋亡的模型。2.利用SMART技术平台和生物信息学分析,筛选得到76个效应克隆。3.对文库筛选出来的效应克隆C20orf108、Liv-1和Ubiquitin B进行了详细的机制研究。目的阐述C20orf108抵抗HDACi诱导细胞凋亡的机制及其功能方法运用SMART技术（Suppression of Mortality byAntisense Rescue Techique）筛选出新基因C20orf108,合成其siRNA,构建正义表达质粒,PCR检测其在不同细胞株的表达情况,运用流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,免疫荧光和WESTEN-BLOTING检测细胞定位,免疫共沉淀技术寻找其相互作用蛋白。结果：本试验证实在MCF-7和HeLa细胞内降低C20orf108的表达可以抵抗HDACi引起的细胞凋亡,增高C20orf108的表达能够促进细胞凋亡,并且这种效应是依赖与线粒体凋亡途径的。C20orf108定位于线粒体内,并且参与了内源性细胞凋亡途径的调控。结论：1.C20orf108是一个调控细胞凋亡的新基因,在肿瘤细胞和正常细胞存在表达差异,并参与了线粒体凋亡途径的调控。2.对文库筛选出来的基因C20orf108参与线粒体凋亡途径调控的方式进行了详细的机制研究。
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标签：反义文库论文; 组蛋白去乙酰化酶抑制剂论文; 凋亡论文; 线粒体论文;