论文摘要
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国沿江地区重点开发的特种水产养殖动物。近年来,随着养殖规模的不断扩大和集约化养殖程度的不断提高,各种病害问题日趋严重,给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的经济损失。在中华绒螯蟹的众多病害中,颤抖病是最常见、危害最为严重的一种。本课题组前期研究证明该病病原体为螺原体,并将其命名为中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris sp.nov）。虽然前期工作已经完成了该病原体的生物学特性与分类地位的研究,以及病原检测和治疗药物的毒理实验,但有关其细胞骨架蛋白功能方面的研究还没有涉及,而螺原体的细胞骨架因为其独特性近年来成为国际研究的热点。因此,本论文在中华绒螯蟹螺原体和非凡螺原体（Spiroplasma mirum）基因组测序和注释工作的基础上,运用多种生物信息学软件,对不同螺原体的细胞骨架蛋白（fib,EF-Tu和MreB 1～5）进行了一系列分析和比较,并开展了三种细胞骨架基因（Fib、EF-Tu和MreB）的实时定量PCR检测以及EF-Tu蛋白的原核表达和多抗制备。1.螺原体细胞骨架蛋白的生物信息学分析中华绒螯蟹螺原体（S. eriocheiris）是第一种发现于淡水甲壳动物中的螺原体,它在各生长时期的形态差异很大,而螺原体是无细胞壁的微生物,所以这种形态学上的变化很可能与细胞骨架有关。因此为了进一步研究其与植物螺原体（柑橘螺原体,Spiroplasma citri）和昆虫螺原体（非凡螺原体,Spiroplasma mirum;蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum）以及其他细菌细胞骨架的关系,本实验首先运用多种生物信息学软件对其细胞骨架蛋白基因（fib, EF-Tu和MreB 1～5）进行了一系列分析。结果表明：（1）这四种螺原体的碱基序列相似性较高,在79%-98%之间；而氨基酸相似性变化较大,在33%-99%之间。（2）用SWISS MODEL软件预测四种螺原体和其他几种细菌的骨架蛋白,并对它们做了比较,发现不同螺原体的同类蛋白在三维结构上几乎完全相同,且与亲缘关系相近的物种相似。例如,在各种细菌EF-Tu （延伸因子）蛋白的三维结构图比较中,三种螺原体与立克次氏体（Richettsia）的结构相似,但与其他细菌如支原体、大肠杆菌、衣原体等有所不同（图2.1）。从三种螺原体Fib蛋白的三维结构图比较中,可以看出其结构相近,尤其是S. eriocheiris与S. mirum的三维结构几乎没有区别,而与柑橘螺原体S. citri有细微差异（图2.2）。2.细胞骨架蛋白的实时定量PCR检测螺原体在培养基中生长不同时期时的形态差异很大。最新报道显示蜜蜂螺原体（S. melliferum） BC3的细胞骨架包含三种主要成分：Fib、EF-Tu和MreB。因此结合已经完成的S. eriocheiris和S. mirum的基因组信息,本实验选择这3种细胞骨架蛋白基因进行荧光定量PCR检测,分析它们在各个生长时期的表达量差异,探讨其与细胞形态之间的关系,为今后研究中华绒螯蟹螺原体的致病机理奠定基础。结果显示,S. eriocheiris在对数期呈典型的螺旋状,平台期呈短棒状,衰亡期则为球状；与以上三个时期相对应的RT-PCR结果显示细胞骨架蛋白基因的表达量随着对数期、平台期、衰亡期逐渐下降。可以看出基因表达量与螺旋形态呈正相关。同样地,S. mirum在对数期呈螺旋状,但螺旋数较少,平台期呈典型的螺旋形,螺旋数较多时还以分枝形式存在,衰亡期则为松散的丝带状；与以上三个时期相对应的RT-PCR结果显示细胞骨架蛋白基因的表达量也是对数期较弱,平台期较多,衰亡期最少。可以看出基因表达量也与螺旋形态呈正相关。综上所述,推测Fib、EF-Tu和MreB这3种细胞骨架蛋白基因对螺原体的螺旋形态起重要作用。3.中华绒螯蟹螺原体细胞骨架蛋白EF-Tu（延伸因子）的克隆、表达以及功能研究本实验首次从中华绒螯蟹螺原体基因组中获得了一个编码细胞骨架蛋白的基因EF-Tu。首先扩增出EF-Tu的部分序列,与质粒pET28连接后,成功转入大肠杆菌中扩增。为了证明实验获得的EF-Tu蛋白具有免疫原性,利用原核载体表达重组融合蛋白EF-Tu-His,采用Ni-NTA亲和层析柱对该融合蛋白进行了纯化,用质谱进行鉴定,然后制备兔多克隆抗体。SDS-PAGE和蛋白免疫印迹表明该蛋白得到了成功表达,且具有免疫原性。为了进一步验证该蛋白是否为螺原体蛋白,本文对中华绒螯蟹螺原体各生长时期的总蛋白进行了分离,并利用制备的EF-Tu多克隆抗体进行检测。Western Blotting检测结果显示：多克隆抗体和总蛋白发生了特异性的免疫反应,在相应的43KDa蛋白位置出现了免疫条带,与预期的结果一致。为进一步研究EF-Tu蛋白在各个时期的表达量差异,分别提取了S.eriocheiris对数期、平台期、衰亡期的总蛋白,用制备的多克隆抗体进行免疫印迹分析。结果表明,EF-Tu蛋白表达量随着对数期、平台期、衰亡期而逐渐增多,与螺原体的螺旋形态呈负相关。这可能有两方面的原因：（1）EF-Tu是多功能蛋白,它可能只起着辅助连接或支撑的作用。随着细菌的生长,行使细胞骨架功能的EF-Tu逐渐减少,转而去行使延伸因子等其他的功能,如协助DNA或RNA的复制、转录等；（2）从基因转录到蛋白质的合成,中间存在许多调控因子,所以可能导致在核酸、蛋白质两个表达水平上产生差异。这些结果为探明螺原体抗原蛋白与宿主相互作用的免疫调节机制以及今后虾蟹类螺原体病害的防治提供了重要的理论依据。