H5和H9亚型禽流感病毒诊断芯片的初步研究

论文摘要

禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病综合征,其中高致病性禽流感被国际兽疫局（OIE）定为A类传染病。AIV基因组含有8个单股负链RNA病毒节段,目前分为16个血凝素（HA）和9个神经氨酸酶（NA）亚型,其亚型鉴定主要依靠血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验,这是世界卫生组织（WHO）进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。基因芯片技术是一种快速、并行、高通量的基因水平的诊断技术,可以应用于并行的检测数百个疾病相关分子,它的出现为禽流感病毒的快速检测和分型提供了可能。本实验利用基因芯片技术在禽流感病毒亚型鉴定上做了初步的研究,希望构建一种在基因水平提供一次样品就可以鉴别流感病毒亚型平台。研究的内容主要包括:1.探针的制备:禽流感病毒的H1H15（无H12）亚型HA基因、N1N9亚型的NA基因、NP基因各分成三段,M基因和NS基因;新城疫、法氏囊和传染性支气管炎病毒的保守基因片段;阳性对照GAPDH基因共85个基因片段用各自特异的引物进行PCR扩增,获得的产物经乙醇沉淀、浓缩、纯化后,将浓度均调整到1μg/μl左右做为探针。2.芯片的制备和反应条件的优化:用点样仪将以上制备的探针、空白对照和pUC-18阴性对照按照设计好的阵列点制到已经包被好的载玻片上制成芯片。通过对点样条件和杂交条件的优化最终确定:探针浓度3001000μg/μl、点样缓冲液为3×SSC+1.5mol甜菜碱、点样湿度在60%RH、杂交温度在42℃、杂交时间在812 h时,杂交信号比较理想。3.样品不同标记方法的比较:通过在反转录过程中用Cy3-Unit12标记和在RT-PCR扩增过程中掺加Cy3-dUTP标记两种不同的方法的比较,成功的建立了通用引物RT-PCR方法在基因芯片上的运用,提高了Cy3的掺加效率,降低了成本。4.芯片的应用:实验主要应用上述方法制备的芯片检测了H5N1和H9N2两种不同亚型的禽流感病毒。结果显示,扫描后获得的芯片图谱与预期亚型相符,达到了利用基因芯片技术鉴定禽流感病毒部分亚型的目的。通过对芯片的灵敏度、特异性、重复性和稳定性的检测,证明本研究制备的芯片可以用于临床。结果表明本实验所建立的基因芯片诊断方法是可行的,为下一步高密度芯片的制备奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 禽流感病毒（AIV）的研究进展
• 1.1.1 禽流感病毒（AIV）形态结构
• 1.1.2 禽流感分子的生物学特性
• 1.1.3 病毒的复制和遗传变异
• 1.2 禽流感诊断方法研究现状
• 1.2.1 临床诊断
• 1.2.2 实验室诊断
• 1.3 基因芯片的研究进展
• 1.3.1 基因芯片的基本概念
• 1.3.2 生物芯片的分类
• 1.3.3 基因芯片的制作方法
• 1.3.4 基因芯片的制备
• 1.3.5 基因芯片的应用
• 1.3.6 生物芯片的研究现状
• 1.3.7 问题与展望
• 1.4 本次研究的目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器设备
• 2.1.2 消耗性试剂
• 2.1.3 实验室常用试剂的配制
• 2.1.4 种毒及质粒
• 2.2 方法
• 2.2.1 禽流感亚型诊断芯片探针的制备
• 2.2.2 反应条件的优化
• 2.2.3 芯片的制备
• 2.2.4 禽流感亚型诊断芯片的检测
• 2.2.5 特异性检测
• 2.2.6 灵敏度检测
• 2.2.7 重复性检测
• 2.2.8 保存期测定实验
• 2.2.9 已鉴定毒株和临床样品的检测
• 3 实验结果
• 3.1 探针制备结果
• 3.1.1 电泳结果
• 3.1.2 各探针浓度测定
• 3.2 反应的条件优化
• 3.2.1 不同基片对杂交的影响
• 3.2.2 不同的湿度对点样的影响
• 3.2.3 不同点样液的影响
• 3.2.4 不同直径点样针的影响
• 3.2.5 不同浓度的探针点样后的杂交结果
• 3.2.6 杂交温度和时间的选择结果
• 3.2.7 Cy3-dUTP 的使用浓度
• 3.3 禽流感亚型诊断芯片检测结果
• 3.3.1 不同荧光标记方法的比较
• 3.3.2 特异性检测
• 3.3.3 灵敏度检测
• 3.3.4 重复性检测
• 3.3.5 保存期的测定
• 3.3.6 已鉴定毒株和临床样品的检测
• 4 讨论
• 4.1 禽流感病毒亚型鉴别检测基因芯片研究的意义
• 4.2 基因芯片引物和目的片段设计原则
• 4.3 基因芯片阵列的设计
• 4.4 基因芯片反应条件的优化
• 4.5 禽流感病毒亚型检测芯片结果分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文