广西猪繁殖与呼吸综合征病毒部分Nsp2、ORF5～7基因的克隆、序列分析及分子流行病学调查研究

论文摘要

2006～2008年广西“高热”病期间,本研究通过RT-PCR的方法从广西不同县市的猪血清、流产胎儿、粪便、肺脏、淋巴结、肾脏中扩增得到25株PRRSV的部分Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7基因。这四个基因与2005年以前的国内PRRSV分离毒株CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2、HN1的核苷酸同源性分别为77.1%～95.3%、81.9%～97.2%、92.0%～99.0%、85.2%～98.1%,氨基酸同源性分别为55.1%～94.0%;76.0%～95.0%、94.8%～98.9%、77.2%～96.0%,与2006-2007的国内PRRSV变异株JXA1、JX0612、HuN、HuN4、HuB1、HEB1的核苷酸同源性分别为96.3%～99.3%、91.5%～99.7%、98.7%～100%、93.0%～100%,氨基酸同源性分别为74.7%～98.8%、84.1%～100%、97.7%～100%、83.7%～100%,可见本研究毒株与2006-2007年分离的变异株同源性较高;遗传进化树分析表明本研究流行毒株属于美洲型的Ⅱ亚群,与JXA1、JX0612、HuN、HuN4、HuB1、HEB1分布在Ⅱ亚群的同一个分支,亲缘关系较近,这表明本研究毒株与PRRSV变异株可能来源于同一个祖先。通过GP5的遗传变异分析发现,广西的PRRSV变异并没有明显的地域性,Ⅱ亚群毒株在广西各县市都有分布;但从时间上分析,2003～2005年的广西毒株和2006～2008年的广西毒株分别分布在Ⅱ亚群的两个分支上,且在9aa、16aa、94aa、185aa位点,本研究毒株与JXA1、JX0612、HUB1、HEB1、HUN、HUN4的变异相同,而2003～2005年的广西毒株却极少发生变异;在54aa、59aa、104aa位点,2003～2005年的广西毒株发生了变异,而本研究的毒株却鲜少发生变异。在GP5中的R13、R151以及M蛋白中的Q16这3个病毒毒力致弱的相关位点,本研究毒株均未发生改变,但位于GP5蛋白中的病毒首要中和表位发生了变异:L39→I39。在Nsp2氨基酸序列中发现,25个毒株序列的第482和第534～562位出现了1个和29个氨基酸的缺失,但这30个氨基酸的缺失可能不会对病毒的生长动力学产生明显影响。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一章 综述
• 1 病毒分子生物学特点
• 2 病毒基因组特点
• 3 Nsp2及ORF5、ORF6、ORF7基因的功能与遗传变异
• 3.1 Nsp2基因的功能与遗传变异
• 3.2 ORF5基因的功能与遗传变异
• 3.3 ORF6基因的功能与遗传变异
• 3.4 ORF7基因的功能与遗传变异
• 4 高致病性猪繁殖与呼吸综合症的流行病学调查
• 4.1 PRRSV在Marc-145细胞的适应性
• 4.2 PRRSV的抗原性
• 4.3 流行特点
• 4.4 临床症状
• 4.5 病理变化
• 4.6 防治措施
• 5 研究遗传变异和分子流行病学调查对控制PRRSV的意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 标本
• 1.2 载体与菌株
• 1.3 分子生物学试剂
• 1.4 试剂的配制
• 1.5 主要仪器
• 1.6 参考的PRRSV毒株核苷酸序列
• 1.6.1 Genbank下载毒株序列
• 1.6.2 本实验室毒株序列
• 2 方法
• 2.1 实验路线
• 2.2 病料的收集和处理
• 2.3 病料阳性鉴定
• 2.4 病毒RNA的提取
• 2.5 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.6 PCR产物胶回收
• 2.7 感受态细胞的制备
• 2.8 基因克隆
• 2.9 基因测序
• 2.10 序列比较
• 2.11 遗传演化分析
• 2.12 推导氨基酸的基本特性比较
• 第三章 结果与分析
• 1 病料的采集
• 2 部分Nsp2基因的扩增、克隆与序列分析
• 2.1 部分Nsp2基因的扩增结果
• 2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 部分Nsp2基因核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性比较
• 2.3.1 与广西分离株GXA、国内代表毒株的序列比较
• 2.3.2 与国外代表毒株的序列比较
• 2.4 部分Nsp2基因推导的氨基酸比较
• 2.5 本研究毒株与国内外毒株遗传进化树分析
• 3 ORF5基因的扩增、克隆与序列分析
• 3.1 ORF5基因的扩增结果
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.3 ORF5基因核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性比较
• 3.3.1 与以前广西流行毒株的序列比较
• 3.3.2 与国内代表毒株的序列比较
• 3.3.3 与国外代表毒株的序列比较
• 3.4 ORF5基因推导编码GP5的氨基酸的比较
• 3.4.1 推导氨基酸序列的保守区/变异区和糖基化位点的变异分析
• 3.4.2 推导氨基酸序列的毒力、准种相关氨基酸位点及抗原表位的变异分析
• 3.5 ORF5基因遗传进化树分析
• 3.5.1 本研究毒株与国内外代表毒株遗传进化树分析
• 3.5.2 本研究毒株与2003-2006年的广西毒株的遗传进化分析
• 4 ORF6基因的扩增、克隆与序列分析
• 4.1 ORF6基因的扩增结果
• 4.2 重组质粒的酶切鉴定
• 4.3 ORF6基因核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性比较分析
• 4.3.1 与以前广西流行毒株序列比较
• 4.3.2 与国内外代表毒株序列比较
• 4.3.3 与国外代表毒株的序列比较
• 4.4 推导氨基酸序列的保守区/变异区、毒力相关位点和糖基化位点的变异
• 4.5 ORF6基因遗传进化树分析
• 4.5.1 本研究毒株与国内外代表毒株遗传进化树分析
• 4.5.2 本研究毒株与2005年的广西毒株的遗传进化分析
• 5 ORF7基因的扩增、克隆与序列分析
• 5.1 ORF6基因的扩增结果
• 5.2 重组质粒的酶切鉴定
• 5.3 ORF7基因核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性比较分析
• 5.3.1 与2005年的广西流行毒株序列比较
• 5.3.2 与国内外代表毒株序列比较
• 5.3.3 与国外代表毒株的序列比较
• 5.4 ORF7基因推导编码的N蛋白氨基酸比较
• 5.4.1 推导氨基酸序列的保守区/变异区和糖基化位点的变异分析
• 5.4.2 N蛋白抗原位点氨基酸的比较
• 5.5 ORF7基因遗传进化树分析
• 5.5.1 本研究毒株与国内外代表毒株遗传进化树分析
• 5.5.2 本研究毒株与2005年的广西毒株的遗传进化分析
• 第四章 讨论
• 1 PRRSV的传播途径分析
• 2 Nsp2基因序列分析
• 3 ORF5基因序列分析
• 4 ORF6基因序列分析
• 5 ORF7基因序列分析
• 6 Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7基因遗传变异对疫苗产生和使用的影响
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录:英文缩写对照表
• 致谢
• 发表文章