柞蚕微孢子虫的全基因组测序及孢壳蛋白的鉴定

论文摘要

微孢子虫是一类寄生于真核细胞内的单细胞真菌类寄生虫,可感染从无脊椎动物到脊椎动物几乎所有的动物,其中包括人类和经济昆虫（如蚕和蜂等）。柞蚕是一种重要的经济昆虫,其蚕蛹体内富含蛋白及各种营养元素,广泛被人们作为食用材料来利用,其生产的柞蚕丝是高级的纺织和医用材料。但柞蚕微孢子虫对柞蚕的养殖业造成很大的危害,严重影响柞蚕产业的发展。本文采用Illumina测序技术对柞蚕微孢子虫的基因组进行了shotgun500bp长度以上的双末端测序,共获得657MbpClean Data,经SOAPdenovo软件组装,得到3536个Scaffolds、5266个Contigs,Scaffold总长度为5797972bp,覆盖全基因组67%,Scaffold的N50为2417bp,GC含量为27.96%,通过Glimmer基因预测,并利用Blast检索NR库、Swissprot库、Trembl库和KEGG库对基因进行注释,结果如下:共预测到3413个基因,通过对COG及KOG数据库的Blast搜索及统计,将所有基因分为25类,分别为DNA重组与修复相关基因、常见功能预测基因、翻译相关基因、核糖体结构与合成基因、伴侣蛋白基因及转录相关基因、细胞内分泌与转运相关基因、碳水化合物代谢相关基因、细胞周期相关基因、信号转导相关基因、细胞骨架相关基因、脂类代谢相关基因、无机离子转运与代谢相关基因、RNA进程相关基因、染色质结构与动力学相关基因、能量产生与转化相关基因、核苷酸与氨基酸转运与代谢相关基因、细胞壁膜相关基因、辅酶转运与代谢相关基因、防卫机制相关基因、次级代谢产物合成转运等相关基因、核结构相关基因及细胞运动相关基因等。其中重组与修复相关基因、常见功能预测基因及翻译相关基因相对含量较高,都在10%以上。柞蚕微孢子虫、家蚕微孢子虫和蜜蜂微孢子虫的GO分类比较分析显示,三种微孢子虫的各分类中基因数量在全部基因数量中所占比例无明显差别。直系同源基因比较研究显示,柞蚕微孢子虫对家蚕微孢子虫有81%的直系同源基因,柞蚕微孢子虫对蜜蜂微孢子虫有62%的直系同源基因,柞蚕微孢子虫对三种微孢子虫共有的直系同源基因有51%。基于兔脑炎微孢子虫（E. cuniculi）等的研究结果推测,在柞蚕微孢子虫感染柞蚕的过程中,孢壁蛋白具有关键性的作用,对孢壁蛋白的研究有利于解明微孢子虫与宿主细胞的互作关系以及柞蚕微孢子虫的侵染机制。利用SDS-PAGE及LC-MS法对柞蚕微孢子虫的孢壳蛋白进行了鉴定,经Mascot软件检索,得到了6种蛋白,本文选择其中3种孢壁蛋白进行了不同微孢子虫间的ClustalX多重序列比对,结果显示,柞蚕微孢子虫与家蚕微孢子虫有着最近的亲缘关系,其次为蜜蜂微孢子虫,而与其他微孢子虫有着相对较远的亲缘关系。经PAML程序包中的YN00的非同义替换（dN）与同义替换（dS）比值分析,发现孢壁蛋白序列在微孢子虫间的dN/dS明显小于1,说明孢壁蛋白在微孢子虫间受到纯化选择压力的作用,同时也说明了微孢子虫功能蛋白高度保守。本研究为进一步开展柞蚕微孢子虫孢壁蛋白质组及其功能研究打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 微孢子虫整体简介
• 1.2 微孢子虫侵染及相关研究
• 1.2.1 发芽机制假说
• 1.2.2 侵染机制假说
• 1.2.3 孢壁蛋白研究概况
• 1.3 微孢子虫基因组研究概况
• 2. 引言
• 2.1 研究背景及意义
• 2.2 本研究的内容
• 2.3 本研究的技术路线
• 3. 柞蚕微孢子虫基因组测序结果及分析
• 3.1 材料
• 3.2 主要试剂与仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 孢子的分离与纯化
• 3.3.2 柞蚕微孢子虫基因组DNA 的提取
• 3.3.3 Shotgun 文库构建
• 3.3.4 原始的测序数据处理
• 3.3.5 数据组装分析
• 3.3.6 基因预测与注释
• 3.3.7 基因归类及比较分析
• 3.4 结果
• 3.4.1 基因组DNA 的质量检测
• 3.4.2 基因组测序与组装及基因预测与注释结果
• 3.4.3 柞蚕微孢子虫直系同源基因的功能分类
• 3.4.4 柞蚕微孢子虫、家蚕微孢子虫及蜜蜂微孢子虫的同源基因比较
• 3.4.5 柞蚕微孢子虫、家蚕微孢子虫和蜜蜂微孢子虫基因的GO 分类结果比较
• 4. 柞蚕微孢子虫孢壳蛋白的提取与质谱鉴定
• 4.1 材料
• 4.2 主要试剂与仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 柞蚕微孢子虫发芽处理和空孢壳的收集
• 4.3.2 柞蚕微孢子虫30kDa 蛋白的提取
• 4.3.3 质谱分析
• 4.4 结果
• 4.4.1 柞蚕微孢子虫空壳层孢子的分离
• 4.4.2 不同方法提取柞蚕微孢子虫蛋白的SDS-PAGE 检测
• 4.4.3 孢壳蛋白的LC-MS 鉴定结果
• 4.4.4 柞蚕微孢子虫几种孢壁蛋白序列同其他种微孢子虫相应序列的比对分析
• 5. 小结
• 5.1 柞蚕微孢子虫基因组测序结果
• 5.2 柞蚕微孢子虫孢壳蛋白的鉴定
• 参考文献
• 附录A 英文缩写全称
• 附录B 作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况
• 附录C 柞蚕微孢子虫的孢壳蛋白的质谱鉴定后的Mascot 检索结果
• 致谢