FoxM1相关重组腺病毒载体小试生产及初步质量控制研究

论文摘要

基因治疗技术最初作为遗传病的一种治疗手段开始被人们熟知。二十多年来,随着基因治疗技术的发展进步,基因治疗已经被应用于多种疾病的治疗,尤其是肿瘤的基因治疗。据全球基因治疗临床数据库的数据显示,目前全球肿瘤基因治疗应用范例中使用最多的载体是腺病毒载体。随着基因治疗向临床转化的深入,对基于腺病毒载体的药物需求日益增大,质量要求也增高,因此大规模临床级别腺病毒载体药物的生产成为一个难题。传统纯化腺病毒的氯化铯密度梯度离心的方法已经不能满足需求,目前层析方法纯化腺病毒已成为规模生产的首选方法。重组腺病毒AdFoxM1shRNA是在FoxM1可作为抑制肿瘤生长的靶基因的基础上研发的新型重组腺病毒药物载体。本研究中我们即利用了AdFoxM1shRNA进行了腺病毒的小试生产和初步质量控制研究。通过引入生产时需构建细胞库的概念,建立了293A细胞的细胞库,确保了后续产品来源的稳定性和同一性。并运用转瓶培养体系扩增293A细胞,进行病毒感染,收集病毒扩增时的上清液。在下游纯化工艺研究中通过摸索超滤浓缩、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等工艺获得了大量的AdFoxM1shRNA重组腺病毒,最后通过纯度、病毒滴度、复制型病毒检测三个核心指标对获得的重组腺病毒进行了初步质量控制研究,并与传统方法获得的重组腺病毒载体进行对比,确定层析方法获得的AdFoxM1shRNA重组腺病毒质量的优越性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写
• 第1章 绪论
• 1.1 基因治疗概述
• 1.2 腺病毒载体概述
• 1.3 腺病毒载体生产概述
• 1.4 转录因子FoxM1简介
• 1.5 本文构思
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究思路及技术
• 第2章 腺病毒包装及在宿主细胞内培养工艺
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料及仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 宿主细胞细胞库构建
• 2.3.2 病毒质粒转染293A细胞
• 2.3.3 病毒噬斑形成及低熔点琼脂糖病毒噬斑挑选实验
• 2.3.4 病毒MOI测定
• 2.3.5 病毒噬斑扩增
• 2.3.6 病毒颗粒转瓶培养系统扩增
• 2.4 结果
• 2.4.1 宿主细胞库建立
• 2.4.2 低熔点琼脂糖病毒噬斑挑选实验
• 2.4.3 病毒颗粒大量扩增
• 2.5 讨论
• 第3章 腺病毒的收获与纯化
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料及仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 腺病毒上清超滤浓缩
• 3.3.2 Benzonase核酸酶消化
• 3.3.3 层析柱组装
• 3.3.4 浓缩液的阴离子交换层析纯化
• 3.3.5 离子交换产物的凝胶过滤纯化
• 3.3.6 HPLC分析
• 50)法测定滴度'>3.3.7 组织培养半数感染剂量(TCID₅₀)法测定滴度
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 层析柱组装
• 3.4.2 上清超滤浓缩及层析前处理分析
• 50)法测定滴度'>3.4.3 组织培养半数感染剂量(TCID₅₀)法测定滴度
• 3.4.4 浓缩液的阴离子交换层析纯化
• 3.4.5 离子交换产物的凝胶过滤纯化
• 3.5 讨论
• 第4章 腺病毒的初步质量控制
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料及仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 腺病毒氯化铯连续密度梯度纯化
• 4.3.2 HPLC法
• 4.3.3 A260紫外吸收法测定病毒颗粒数
• 50)法测定滴度'>4.3.4 组织培养半数感染剂量(TCID₅₀)法测定滴度
• 4.3.5 病毒比滴度
• 4.3.6 SDS-PAGE凝胶电泳
• 4.3.7 A549细胞RCA检测法
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 腺病毒氯化铯密度梯度离心纯化结果
• 4.4.2 HPLC分析结果
• 4.4.3 病毒滴度测定
• 4.4.4 SDS-PAGE凝胶电泳检测hexon实验结果
• 4.4.5 A549细胞检测法
• 4.5 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录B 常用缓冲液和试剂配方
• 致谢
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文目录