大肠杆菌莽草酸代谢途径的相关研究

论文摘要

莽草酸（shikimic acid, SA）是芳香族氨基酸合成途径——莽草酸代谢途径中的重要中间产物,有着众多生理功能,而且莽草酸是合成治疗和预防H5N1型禽流感的药物（商品名“达菲”）的原料之一,其需求量甚大。实验室前期构建了aroL基因缺陷株JDL02,并通过强化表达编码PEP合成酶、转酮醇酶和3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）合成酶基因ppsA、tktA及aroG,使莽草酸摇瓶发酵产量从3.0mg/L提高到94.3mg/L。本课题首先优化了工程菌pTrc-aroG-tktA/JDL02的摇瓶发酵条件,结果表明在二次培养7.5h加入终浓度为0.167mg/mL的IPTG进行诱导,使莽草酸产量提高到224.324mg/L。aroB基因编码DHQ合成酶,是莽草酸途径的第一个限速酶,为调查其对莽草酸合成的影响,将aroB基因表达盒导入JDL02后,发现莽草酸产量提高到72.165mg/L。aroK基因编码产物莽草酸激酶Ⅰ是aroL基因编码产物的同工酶,为研究其对莽草酸代谢的影响,本课题进行了aroK基因的敲除。经多项尝试,最终采用回补莽草酸后的温敏质粒灭活系统,获得了染色体上敲除aroK基因的大肠杆菌JM83二次重组子,由此说明aroK基因的敲除可能会影响其下游aroB基因的功能表达从而阻断莽草酸的合成。除此以外还调查了莽草酸对大肠杆菌生长的抑制作用,结果发现莽草酸对大肠杆菌的抑制浓度在5～10mg/mL之间,因此提高大肠杆菌对莽草酸的耐受性是实现大肠杆菌高产莽草酸的另一个关键问题。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 综述与导言
• 1.1 莽草酸概述
• 1.1.1 莽草酸的性质
• 1.1.2 莽草酸的作用以及其市场应用情况
• 1.1.3 目前常用的莽草酸合成、提取方法
• 1.2 大肠杆菌莽草酸代谢途径
• 1.3 大肠杆菌莽草酸代谢途径相关基因
• 1.3.1 莽草酸激酶的编码基因
• 1.3.2 DHQ合成酶的编码基因
• 1.4 温敏灭活质粒灭活方法原理
• 1.5 蛋白质的分子进化技术
• 1.5.1 化学诱变法
• 1.5.2 易错PCR（error-prone PCR）
• 1.5.3 DNA改组技术（DNA shuffing）
• 1.5.4 非同源DNA改组技术
• 1.5.5 延伸诱变法
• 1.6 课题研究背景及工作目标
• 1.6.1 研究背景
• 1.6.2 作目标
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 化学药品与生物试剂
• 2.1.2 大肠杆菌培养基
• 2.1.3 缓冲液
• 2.1.4 菌种
• 2.1.5 载体质粒
• 2.1.6 重组质粒
• 2.1.7 实验仪器与设备
• 2.2 微生物学方法
• 2.2.1 细菌培养条件
• 2.2.2 菌种的保藏
• 2.3 遗传学方法
• 2.3.1 三天用大肠杆菌钙转感受态细胞的制备
• 2.3.2 大肠杆菌的转化（钙转）
• 2.3.3 Red重组功能的诱导和大肠杆菌电转感受态细胞的制备
• 2.3.4 大肠杆菌的转化（电转）
• 2.3.5 利用温敏质粒敲除大肠杆菌染色体上的目的基因
• 2.4 分子生物学方法
• 2.4.1 大肠杆菌中质粒DNA的抽提（沸水浴法）
• 2.4.2 DNA的酶切
• 2.4.3 DNA的连接
• 2.4.4 DNA的沉淀
• 2.4.5 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.6 DNA的琼脂糖凝胶回收（Kit）
• 2.4.7 大肠杆菌中质粒DNA的抽提（Kit）
• 2.4.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5 莽草酸的检测
• 2.6 实验过程中使用的生物学软件
• 第3章 结果与分析
• 3.1 莽草酸检测的稳定性实验及摇瓶培养优化
• 3.1.1 高碘酸显色法测定莽草酸稳定性的检验
• 3.1.2 莽草酸标准曲线的绘制
• 3.1.3 培养环境的检验
• 3.1.4 诱导剂量的优化
• 3.1.5 诱导时间的优化
• 3.2 实验室前期构建的莽草酸生产菌株的产量测定
• 3.3 莽草酸对大肠杆菌生长抑制的初步研究
• 3.3.1 第一次抑菌实验
• 3.3.2 第二次抑菌实验
• 3.3.3 第三次抑菌实验
• 3.3.4 液体抑菌实验
• 3.4 aroB基因的强化表达
• 3.4.1 aroB基因的克隆
• 3.4.2 表达质粒pTrc-aroB的构建
• 3.4.3 SDS-PAGE检测aroB基因的表达
• 3.4.4 aroB强化表达菌株的莽草酸产量的测定
• 3.5 aroK基因的敲除研究
• 3.5.1 灭活质粒pMAK-aroK（f）（b）的鉴定
• 3.5.2 大肠杆菌染色体上aroK基因的敲除
• 3.5.3 回补aroK进行大肠杆菌染色体上aroK基因的敲除
• 3.5.4 通过移码突变进行大肠杆菌染色体上aroK基因的敲除
• 3.5.5 培养基中加入莽草酸后进行大肠杆菌染色体上aroK基因的敲除
• 第4章 讨论
• 4.1 关于莽草酸对于大肠杆菌抑菌作用问题的展望
• 4.1.1 紫外诱变
• 4.1.2 采取全转录系统的改变
• 4.1.3 多基因组工程改变细胞形状
• 4.2 关于温敏质粒pMAK-705进行基因敲除过程中需要注意问题
• 4.2.1 一次重组转化时温度控制的研究
• 4.2.2 获得二次重组子的操作研究
• 4.2.3 对于整个灭活过程进行缩减的研究
• 4.3 关于aroK基因敲除问题的进一步研究展望
• 4.3.1 多种移码突变的研究
• 4.3.2 aroB基因回补后进行aroK基因敲除实验
• 4.4 关于构建不需添加芳香族物质进行生产的工程菌的构想
• 4.5 课题前景展望
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录