重组蛋白GGH的分离纯化及药效学初步评价

论文摘要

胰高血糖素样肽-1由肠道L细胞合成和分泌的一个30个氨基酸的多肽,它不仅能刺激胰岛β细胞增殖、抑制β细胞凋亡,而且延缓胃排空和抑制食欲。但其在体内的半衰期只有26 min,大大限制了其应用。为克服GLP-1半衰期短的缺点,实现其在体内的长效作用,本实验室成功构建了胰高血糖素样多肽-1（GLP-1）与人血清白蛋白的融合体（GGH）,本文对表达成功的融合蛋白GGH进行分离纯化的优化和药效学初步评价,主要结论如下:融合蛋白GGH分离纯化步骤:发酵液8000 r/min离心8 min,0.65μm的微滤膜微滤,采用截留分子量为10 kDa的超滤膜超滤20倍,依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25层析柱,得到的目的蛋白经过HPLC和SDS-PAGE检测纯度达到98.48%以上,回收率为28.9%,内毒素含量10 EU/mg。口服糖耐量实验,评价融合蛋白GGH的最小有效量、最大剂量的耐受性、静脉注射给药时的量-效关系,皮下注射给药时的量-效和时-效关系。静脉给药在剂量1.0 mg/Kg6.0 mg/Kg范围内、皮下注射给药GGH（2.0、4.0、6.0 mg/Kg）做量-效关系的对数曲线,成线性关系;提前8 h皮下注射给药降低葡萄糖负荷后血糖升高的量-效关系最好。融合蛋白GGH对C57BL/6小鼠β细胞损伤模型和正常C57BL/6小鼠胃排空模型进行药效学初步评价。与模型对照组相比,融合蛋白GGH（2.0、6.0、18.0 mg/Kg）可以显著提高β细胞损伤模型小鼠的胰岛素水平;降低小鼠的饮食量、饮水量和尿量;促进肝/肌糖原的合成,降低血糖水平;免疫组化结果显示融合蛋白GGH可以促进胰岛β细胞的增殖、刺激胰岛素的表达、抑制胰高血糖素的表达。融合蛋白GGH（2.0、4.0、6.0 mg/Kg）可以显著降低正常C57BL/6小鼠的胃排空和延缓肠推进。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 糖尿病的发病机理及治疗策略
• 1.1.1 糖尿病的发病机理
• 1.1.2 糖尿病的治疗策略
• 1.2 GLP-1 生理功能
• 1.2.1 GLP-1 对胰岛功能的影响
• 1.2.2 GLP-1 刺激胰岛素分泌和增加胰岛素的敏感性
• 1.2.3 GLP-1 抑制胰高血糖素的分泌
• 1.2.4 GLP-1 降低外周血糖
• 1.2.5 GLP-1 对食欲和胃排空的作用
• 1.3 GLP-1 的长效性研究
• 1.4 重组人血清白蛋白的分离纯化方法
• 1.4.1 重组人血清白蛋白的粗分离阶段
• 1.4.2 重组人血清白蛋白的精细分离阶段
• 1.4.3 重组人血清白蛋白纯化的发展趋势
• 1.4.4 重组蛋白GGH 纯化工艺进展
• 1.5 糖尿病动物模型
• 1.5.1 化学药物诱导的动物模型
• 1.6 本课题研究的意义和内容
• 1.6.1 本课题研究的意义
• 1.6.2 本课题的研究内容
• 第二章 融合蛋白GGH 的分离纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料和试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 分离纯化方法
• 2.2.4 纯度检测方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 超滤浓缩
• 2.3.2 Blue Sepharose 6 Fast Flow 层析
• 2.3.3 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）层析
• 2.3.4 Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析
• 2.3.5 凝胶Sephadex G-25 层析
• 2.3.6 融合蛋白GGH 纯化工艺
• 2.3.7 融合蛋白的Western Blotting 鉴定
• 2.3.8 融合蛋白的纯度鉴定
• 2.4 本章小结
• 第三章 融合蛋白GGH 对正常C57BL/6 小鼠量-效和时-效关系
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要试剂和仪器
• 3.2.2 实验动物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 静脉给药的最小有效量
• 3.3.2 静脉给药的量-效关系
• 3.3.3 皮下给药的时-效关系
• 3.3.4 正常小鼠空腹血糖的影响
• 3.3.5 正常小鼠最大剂量的耐受性
• 3.3.6 融合蛋白GGH 对正常C57BL/6 食欲和胃排空的影响
• 3.3.7 统计学分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 最小有效量
• 3.4.2 静脉给药的量-效关系
• 3.4.3 皮下给药的时-效关系
• 3.4.4 对正常小鼠空腹血糖的影响
• 3.4.5 最大剂量的耐受性
• 3.4.6 食欲、胃排空和肠推进的影响
• 3.5 本章小结
• 第四章 融合蛋白GGH 对模型小鼠的药效学评价
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 实验动物
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 β细胞损伤动物模型的建立与给药观察
• 4.3.2 组织学标本制备及HE 染色
• 4.3.4 统计学分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 融合蛋白GGH 对模型小鼠空腹血糖的影响
• 4.4.2 融合蛋白GGH 对模型小鼠体重、饮食和饮水量的影响
• 4.4.3 融合蛋白GGH 对模型小鼠血清胰岛素水平的影响
• 4.4.4 融合蛋白GGH 对模型小鼠肝糖原和肌糖原的影响
• 4.4.5 融合蛋白GGH 对胰岛组织病理学的改变
• 4.5 本章小结
• 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文