新型荧光试剂的合成及标记方法研究

论文摘要

荧光衍生化方法是提高色谱检测灵敏度的重要途径。本论文以发展新型荧光试剂及标记方法为目标,制备了多种新型荧光衍生化试剂,并建立了相应的HPLC分离分析方法。采用量子化学计算方法,对咔唑和吖啶酮类荧光试剂分子进行了几何构型优化和荧光激发光谱计算研究。通过设计合理的反应路线,制备了以咔唑为母体荧光团的新型羰基标记荧光试剂—咔唑-9-乙氧基碳酰肼（CEOC-Hydrazide）,以二氟化硼-二吡咯甲烷为母体荧光团的活性环氧基荧光试剂—1,3,5,7-四甲基-8-苯基-（4-氧基-（3-环氧丙基））-二氟化硼-二吡咯甲烷（TMEPBODIPY）,以及基于1,2-苯并-3,4-二氢咔唑荧光团的标记试剂—1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙基-对甲苯磺酸酯（BDETS）和1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙氧基碳酰肼（BCEOC-Hydrazide）。衍生反应不仅快速、简单,而且可以显著改善样品的分离度和检测灵敏度。研究了新型羰基标记荧光试剂,CEOC-Hydrazide和BCEOC-Hydrazide,对糖醛类化合物的衍生反应,并发展了相应的HPLC分离分析方法。衍生反应可在水浴中进行;对甲醛的衍生反应可在30 min内完成;糖类化合物和甲醛的衍生物平均检出限分别达到35 fmol和9.8 fmol。建立了羧基标记荧光试剂BDETS和9-（2-羟乙基）-吖啶酮（HEA）对10种胆汁酸的柱前衍生HPLC分析方法。衍生反应条件温和;两者与胆汁酸衍生物的平均检出限分别达到8.3 fmol和149.1 fmol。进一步完善了咔唑-9-乙基氯甲酸酯（CEOC）作为实用荧光试剂对脂肪胺的衍生及HPLC的分离分析方法。衍生反应可在5 min内完成;23种衍生物的分离仅需1 h。此外,也将其应用于芳香胺和酚类化合物的分析中,平均检出限分别达到7.6 fmol和162.4 fmol。将具有活性环氧基团的荧光试剂TMEPBODIPY和3-环氧丙基荧光素（EPF）应用于对蛋白质的荧光标记。通过对比实验,证明了这两种试剂可以对蛋白质进行选择性标记,有望在蛋白质组学研究中发挥重要作用。

论文目录

• 摘 要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 荧光的基础理论
• 1.1.1 荧光的发现和产生原理
• 1.1.2 荧光强度与荧光量子产率
• 1.1.3 荧光与试剂分子结构的关系
• 1.1.3.1 共轭π键体系
• 1.1.3.2 共轭π键体系的平面性和刚性的影响
• 1.1.3.3 取代基的影响
• 1.1.4 环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响
• 第二节 衍生反应方式及试剂的构成和要求
• 1.2.1 衍生反应方式
• 1.2.1.1 柱前衍生化
• 1.2.1.2 柱后衍生化
• 1.2.1.3 柱中衍生化
• 1.2.2 衍生试剂的构成和要求
• 第三节 荧光衍生化试剂的类型及其应用
• 1.3.1 氨基的衍生试剂
• 1.3.1.1 磺酰氯类
• 1.3.1.2 氯甲酸酯类
• 1.3.1.3 邻二甲醛类
• 1.3.1.4 活性卤类
• 1.3.1.5 N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类
• 1.3.1.6 异氰酸酯类
• 1.3.2 巯基的衍生试剂
• 1.3.2.1 碘乙酰胺类
• 1.3.2.2 马来酰亚胺类
• 1.3.3 羟基的衍生试剂
• 1.3.4 羰基的衍生试剂
• 1.3.4.1 肼类
• 1.3.4.2 氨基类
• 1.3.5 羧酸的衍生试剂
• 1.3.5.1 重氮甲烷基类
• 1.3.5.2 溴甲基类
• 1.3.5.3 哌嗪基类
• 1.3.5.4 磺酸酯类
• 第四节 本论文的工作
• 第二章 咔唑和吖啶酮类衍生物的量子化学研究
• 第一节 量子化学计算原理和方法
• 2.1.1 引言
• 2.1.2 计算软件
• 2.1.3 计算方法
• 2.1.3.1 分子力学方法
• 2.1.3.2 电子结构方法
• 2.1.3.3 量子化学激发态计算方法
• 第二节 量化计算结果
• 2.2.1 引言
• 2.2.2 实验部分
• 2.2.2.1 计算过程
• 2.2.3 结果和讨论
• 2.2.3.1 荧光试剂分子中各原子净电荷值的分布
• 2.2.3.2 荧光试剂分子的平面性
• 2.2.3.3 荧光激发光谱的计算
• 本章小结
• 第三章 新型羰基标记荧光试剂的合成及对糖醛的柱前衍生 HPLC 方法研究
• 第一节 两种碳酰肼类羰基标记荧光试剂的制备
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 实验部分
• 3.1.2.1 仪器与试剂
• 3.1.2.2 路线设计及合成方法
• 3.1.2.2.1 路线设计
• 3.1.2.2.2 合成方法
• 3.1.2.3 色谱及光谱分析
• 第二节 咔唑-9-乙氧基碳酰肼对中性糖的柱前衍生HPLC 方法研究
• 3.2.1 引言
• 3.2.2 实验部分
• 3.2.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2.2 实验方法
• 3.2.2.2.1 溶液配制
• 3.2.2.2.2 衍生化过程
• 3.2.2.2.3 ESI-MS 条件
• 3.2.2.2.4 色谱分离条件
• 3.2.3 结果与讨论
• 3.2.3.1 CEOC-Hydrazide 与中性糖的衍生反应
• 3.2.3.2 衍生反应时间对衍生化的影响
• 3.2.3.3 衍生体系醋酸含量对衍生化反应的影响
• 3.2.3.4 分离条件的选择
• 3.2.3.5 CEOC-Hydrazide 与中性糖衍生物的色谱分离
• 3.2.3.6 衍生产物质谱分析
• 3.2.3.7 线性范围及检出限
• 第三节 1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙氧基碳酰肼对甲醛的柱前衍生 HPLC方法研究
• 3.3.1 引言
• 3.3.2 实验部分
• 3.3.2.1 仪器与试剂
• 3.3.2.2 实验方法
• 3.3.2.2.1 溶液配制
• 3.3.2.2.2 衍生化过程
• 3.3.2.2.3 APCI-MS 条件
• 3.3.2.2.4 色谱分离条件
• 3.3.3 结果与讨论
• 3.3.3.1 BCEOC-Hydrazide 与甲醛的衍生化反应
• 3.3.3.2 催化剂对衍生反应的影响
• 3.3.3.3 衍生反应时间对衍生化的影响
• 3.3.3.4 衍生反应温度对衍生化的影响
• 3.3.3.5 衍生试剂浓度的影响
• 3.3.3.6 衍生反应的重现性
• 3.3.3.7 BCEOC-Hydrazide 与甲醛衍生物的色谱分离
• 3.3.3.8 衍生产物质谱分析
• 3.3.3.9 线性范围及检出限
• 本章小结
• 参考文献
• 第四章 新型羧基标记荧光试剂的合成及对胆汁酸的柱前衍生 HPLC 方法研究
• 第一节 新型磺酸酯类及羟基类羧基标记荧光试剂的制备
• 4.1.1 引言
• 4.1.2 实验部分
• 4.1.2.1 仪器与试剂
• 4.1.2.2 路线设计及合成方法
• 4.1.2.2.1 路线设计
• 4.1.2.2.2 合成方法
• 4.1.2.3 色谱及光谱分析
• 第二节 1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙基-对甲苯磺酸酯对胆汁酸柱前衍生HPLC 方法研究
• 4.2.1 引言
• 4.2.2 实验部分
• 4.2.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2.2 试剂的纯化处理和制备
• 4.2.2.3 衍生化过程
• 4.2.2.4 样品预处理
• 4.2.2.5 色谱分离条件
• 4.2.3 结果与讨论
• 4.2.3.1 BDETS 与胆汁酸的衍生反应
• 4.2.3.2 衍生反应时间对衍生化的影响
• 4.2.3.3 衍生反应温度对衍生化的影响
• 4.2.3.4 催化剂对衍生反应的影响
• 4.2.3.5 胆汁酸衍生物的色谱分离
• 4.2.3.6 回归及检出限
• 第三节 9-（2-羟乙基）-吖啶酮柱对胆汁酸柱前衍生HPLC 方法研究
• 4.3.1 引言
• 4.3.2 实验部分
• 4.3.2.1 仪器与试剂
• 4.3.2.2 实验方法
• 4.3.2.2.1 试剂的纯化处理和制备
• 4.3.2.2.2 样品预处理
• 4.3.2.2.3 色谱分离条件
• 4.3.2.2.4 衍生化条件
• 4.3.3 结果与讨论
• 4.3.3.1 9-（2-羟乙基）-吖啶酮与胆汁酸衍生反应
• 4.3.3.2 反应时间对衍生化的影响
• 4.3.3.3 反应温度对衍生化的影响
• 4.3.3.4 胆汁酸衍生物的色谱分离
• 4.3.3.5 回归及检出限
• 本章小结
• 参考文献
• 第五章 咔唑-9-乙基氯甲酸酯对氨类和酚类化合物的柱前衍生HPLC 方法研究
• 第一节 咔唑-9-乙基氯甲酸酯的制备
• 5.1.1 引言
• 5.1.2 实验部分
• 5.1.2.1 仪器与试剂
• 5.1.2.2 路线设计及合成方法
• 5.1.2.2.1 路线设计
• 5.1.2.2.2 合成方法
• 5.1.2.3 色谱及光谱分析
• 第二节 咔唑-9-乙基氯甲酸酯对脂肪族氨类化合物的柱前衍生方法研究及色谱分析
• 5.2.1 引言
• 5.2.2 实验部分
• 5.2.2.1 仪器
• 5.2.2.2 试剂
• 5.2.2.3 溶液配制
• 5.2.2.4 实验方法
• 5.2.2.4.1 HPLC 实验
• 5.2.2.4.2 电泳实验
• 5.2.2.4.3 电色谱实验
• 5.2.2.4.4 衍生化过程
• 5.2.3 结果与讨论
• 5.2.3.1 衍生反应条件考察与优化
• 5.2.3.1.1 过量衍生试剂的去除
• 5.2.3.1.2 pH 值对衍生化反应的影响
• 5.2.3.1.3 衍生试剂浓度的影响
• 5.2.3.1.4 衍生反应的重现性
• 5.2.3.2 脂肪胺衍生物的HPLC 分离
• 5.2.3.3 脂肪胺类化合物的电色谱梯度洗脱分离
• 5.2.3.4 CEOC 衍生化氨基酸的毛细管胶束电动色谱分离
• 第三节 咔唑-9-乙基氯甲酸酯对芳香胺柱前衍生HPLC 方法研究
• 5.3.1 引言
• 5.3.2 实验部分
• 5.3.2.1 仪器与试剂
• 5.3.2.2 溶液配制
• 5.3.2.3 衍生化过程
• 5.3.2.4 色谱分离条件
• 5.3.3 结果与讨论
• 5.3.3.1 pH 值对衍生化反应的影响
• 5.3.3.2 反应时间对衍生化反应的影响
• 5.3.3.3 衍生试剂浓度的影响
• 5.3.3.4 衍生反应的重现性
• 5.3.3.5 芳香胺衍生物色谱分离
• 5.3.3.6 线性范围及检出限
• 第四节 新型氯甲酸酯类荧光试剂对酚类柱前衍生HPLC 方法研究
• 5.4.1 引言
• 5.4.2 实验部分
• 5.4.2.1 仪器与试剂
• 5.4.2.2 实验方法
• 5.4.2.2.1 溶液配制
• 5.4.2.2.2 样品预处理
• 5.4.2.2.3 衍生化过程
• 5.4.2.2.4 色谱分离条件
• 5.4.3 结果与讨论
• 5.4.3.1 pH 值对衍生化反应的影响
• 5.4.3.2 反应时间对衍生化反应的影响
• 5.4.3.3 衍生试剂浓度的影响
• 5.4.3.4 衍生反应的重现性
• 5.4.3.5 酚类衍生物色谱分离
• 5.4.3.6 线性范围及检出限
• 5.4.3.7 打印机墨水中苯酚的衍生分析
• 本章小结
• 参考文献
• 第六章 新型活性环氧基荧光试剂的合成及对蛋白质的荧光标记
• 第一节 新型活性环氧基荧光试剂的制备
• 6.1.1 引言
• 6.1.2 实验部分
• 6.1.2.1 仪器与试剂
• 6.1.2.2 路线设计及合成方法
• 6.1.2.2.1 路线设计
• 6.1.2.2.2 合成方法
• 6.1.3 结果与讨论
• 6.1.3.1 试剂合成
• 6.1.3.2 光谱分析
• 第二节 新型活性环氧基荧光试剂对蛋白的标记及HPLC 分析
• 6.2.1 引言
• 6.2.2 实验部分
• 6.2.2.1 仪器与试剂
• 6.2.2.2 实验方法
• 6.2.2.2.1 溶液配制
• 6.2.2.2.2 BSA 的荧光标记与纯化
• 6.2.2.2.3 荧光标记BSA 的酶解
• 6.2.2.2.4 色谱分离条件
• 6.2.2.2.5 SDS-PAGE 分离条件
• 6.2.3 结果与讨论
• 6.2.3.1 荧光标记BSA 高效液相色谱分离
• 6.2.3.2 EPF 荧光标记多肽的二级质谱分析
• 6.2.3.3 荧光标记BSA 酶解产物的色谱分离
• 6.2.3.4 荧光标记人血浆蛋白酶解产物荧光检测与质谱检测的对比
• 6.2.3.5 荧光标记蛋白质的荧光检测与质谱检测灵敏度对比
• 本章小结
• 参考文献
• 作者简介及发表文章目录
• 致谢