猪干扰素-γ的表达、纯化及生物学活性研究

论文摘要

干扰素-γ（Interferon-gamma,IFN-γ）是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子,主要由活化的T细胞和NK细胞产生。IFN-γ对机体免疫系统具有强大的调节作用,是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分,因此,IFN-γ在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用,是现代分子生物学、免疫学和临床医学研究的热点之一。本研究依照猪IFN-γ（pIFN-γ）基因序列,去除信号肽后设计引物,PCR扩增该基因并克隆至原核表达载体pET-30a ,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,转化入寄主菌BL21 （DE3）,用IPTG进行重组pIFN-γ诱导表达,并对该表达系统的表达条件进行优化,结果表明:重组pIFN-γ得到正确的诱导表达,表达的最佳条件为在LB培养基中28℃诱导8 h,诱导剂浓度为0.1 mmol/L。此外还发现,无论在何种条件下进行诱导表达,包涵体形式的重组蛋白较可溶性形式的量多,降低诱导表达温度可使可溶性形式的重组蛋白量增加。可溶性的表达产物用镍亲和层析柱纯化,再用Sephadex-G100做进一步纯化;而包涵体产物经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化。纯化后的表达产物经SDS-PAGE、Western blot分析证实得到了高纯度的重组pIFN-γ。对纯化的重组pIFN-γ进行了一系列生物活性的研究:（1）用细胞病变抑制法对纯化的重组猪IFN-γ进行抗病毒活性测定,结果表明纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制活性,在PK15细胞系上其对伪狂犬病毒（PRV）的抑制活性为2.0×103 U·mg-1,对标准O型口蹄疫病毒抑制活性为2.56×105 U·mg-1;（2）用纯化的重组猪IFN-γ对培养的传代细胞PK15进行诱导,结果显示pIFN-γ在高浓度时可诱导PK15细胞发生凋亡;（3）在体外以不同剂量的重组猪干扰素-γ刺激PK15细胞和猪腹腔巨噬细胞,再用弓形虫进行攻击感染,结果随着猪干扰素-γ的剂量的增大,巨噬细胞抗虫作用增强,而不同浓度的重组猪干扰素-γ对侵入PK15细胞内的弓形虫均无明显影响。本研究为猪IFN-γ相关的基因工程生物制品的开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 干扰素-Γ的研究进展
• 1.2.1 干扰素-γ的产生和结构特点
• 1.2.2 干扰素-γ的生物学特性及作用机制
• 1.2.3 干扰素-γ的测定
• 1.2.4 IFN-γ受体及其介导的信号传递
• 1.2.5 干扰素-γ的应用
• 1.3 研究内容和方法
• 第二章 猪干扰素-Γ的表达和纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种和载体
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液
• 2.1.5 仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的片段的扩增与回收
• 2.2.2 目的片段和载体的酶切与回收
• 2.2.3 目的片段与载体的连接
• 2.2.4 感受态细胞的制备
• 2.2.5 连接产物的转化
• 2.2.6 重组质粒的提取与鉴定
• 2.2.7 重组菌的诱导表达、最佳表达条件的优化及SDS-PAGE 电泳分析
• 2.2.8 rpIFN-γ高效表达产物的纯化
• 2.2.9 纯化表达产物的检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 原核表达载体的构建及鉴定
• 2.3.2 rpIFN-γ诱导表达条件的优化
• 2.3.3 纯化表达产物的检测
• 2.4 分析与讨论
• 第三章 重组猪干扰素-Γ的抗病毒活性分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验细胞和病毒
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 溶液
• 3.1.4 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 PK15 细胞的培养
• 3.2.2 病毒毒价测定
• 3.2.3 重组pIFN-γ抗病毒活性分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 PRV 和标准O 型FMDV 毒价测定
• 3.3.2 rpIFN-γ抗病毒活性测定
• 3.4 分析与讨论
• 第四章 重组猪干扰素-Γ体外抗弓形虫作用研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 虫株、细胞和实验动物
• 4.1.3 溶液
• 4.1.4 仪器与设备（与第三章3.1.4 相同）
• 4.2 方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 弓形虫悬液制备
• 4.2.3 培养细胞弓形虫攻虫剂量的测定
• 4.2.4 重组猪IFN-γ诱导培养细胞抗弓形虫试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 弓形虫致培养细胞病变观察
• 4.3.2 弓形虫攻虫剂量的确定
• 4.3.3 重组猪IFN-γ诱导细胞抗弓形虫结果
• 4.4 分析与讨论
• 第五章 重组猪干扰素-Γ诱导的细胞凋亡
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验细胞
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 溶液
• 5.1.4 仪器与设备（与第三章3.1.4 相同）
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 PK15 细胞培养：（与第三章3.2.1 相同）
• 5.2.2 抗PK15 细胞增殖试验
• 5.2.3 猪干扰素-γ诱导和收集PK15 细胞
• 5.2.4 DNA 提取与电泳分析
• 5.2.5 Hoechest 染色检测PK15 细胞凋亡
• 5.3 结果
• 5.3.1 rpIFN-γ对PK15 细胞增殖抑制试验
• 5.3.2 细胞形态的改变
• 5.3.3 DNA 电泳分析
• 5.3.4 Hoechest 染色检测PK15 细胞凋亡
• 5.4 分析与讨论
• 第六章 结论
• 参考文献（REFERENCES）
• 附录 1: 表达载体 PET-30A（﹢）质粒图谱
• 附录 2: 重组质粒 PET-30A-PIFN-Γ 测序图谱
• 致谢
• 作者简介