柑橘衰退病毒侵染对寄主植物同工酶影响和诱导表达病程相关蛋白的分析

论文摘要

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）广泛发布于世界各柑橘产区,在柑橘上该病毒可导致树体的严重衰退。在使用抗病或耐病的砧木品种,虽不表现明显症状,但可影响树体生长和果实品质。已有研究表明,CTV存在明显的株系分化,根据其在指示植物上的症状表现可分为弱毒株系（mild strains）、诱导衰退株系（decline-inducing strains）和茎陷点株系（stem pitting strains）。本研究分析了CTV强毒和弱毒株系侵染具不同抗性柑橘后在互作过程中寄主叶片防御相关酶活性及其同工酶谱变化,同时对病毒侵染植株中可溶性蛋白和酸性病程相关蛋白进行了分析,主要结果如下:1.采用TAS-ELISA法对接种CTV强毒及弱毒株系的甜橙和枳壳植株中CTV进行了检测,结果表明,在感病品种甜橙植株CTV检测结果均呈阳性反应,而同期接种的抗CTV品种枳壳则呈阴性反应。进一步采用RT-PCR的方法对该枳壳样品中的CTV进行检测,均扩增出大小为672bp的目标产物,表明CTV已嫁接传毒至枳壳植株中,且在抗病和感病寄主植物中该病毒浓度存在明显差异。2.测定CTV弱毒（N4）和强毒（N21、N25）株系接种的墨西哥莱檬、甜橙和枳壳植株叶片中过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性。结果表明,POD和PPO活性变化因病毒株系及寄主的不同而存在差异。在墨西哥莱檬植株中,弱毒和强毒株系接种后均导致POD活性的显著降低,其中弱毒株系N4接种的植株中POD的活性较未接种植株降低最为明显;CTV弱毒株系N4和强毒株系N21接种的植株的PPO活性与未接种植株间无显著性差异,而CTV强毒株系N25接种的植株PPO活性明显增加。在甜橙植株中,CTV弱毒株系N4接种对POD活性无明显影响,而强毒株系N21和N25接种的甜橙植株POD活性显著性增强;不同株系接种的甜橙植株PPO活性无明显差异。在枳壳植株中,而无论接种CTV强毒或弱毒株系,这两种酶的活性均无明显的变化。3.以未接种植株为对照,分析CTV强毒和弱毒株系接种的墨西哥莱檬、甜橙及枳壳中POD、PPO及酯酶（EST）同工酶谱,结果表明,CTV强毒和弱毒株系接种后,这3种寄主植物叶片中POD和PPO同工酶谱未出现变化。但不同株系接种的后对酯酶同工酶谱产生一定的影响,其中强毒株系N25接种的甜橙样品较未接种植株及弱毒株系N4接种的样品多出4条EST同工酶带;CTV弱毒株系N4接种的枳壳样品较未接种植株及强毒株系N25接种的枳壳样品多出2条EST同工酶带。4.分析CTV接种对叶片可溶性蛋白含量的影响,结果表明,CTV强毒株系接种的墨西哥莱檬植株叶片的可溶性蛋白（SPR）增加,其中老叶SPR含量增加更为明显。可溶性蛋白电泳分析结果显示,CTV弱毒和强毒株系接种甜橙、墨西哥莱蒙及酸橙后,其可溶性蛋白条带数略有变化。而CTV弱毒和强毒株系接种枳壳,其可溶性蛋白条带无变化。5.分析CTV弱毒株系接种的甜橙枝条不同部位叶片中酸性病程相关蛋白,结果显示,老叶的蛋白含量及蛋白条数都明显地多于新叶。以基部叶片为材料,分析CTV强毒及弱毒株系接种的甜橙和枳壳的酸性病程相关蛋白,结果显示,CTV强毒株系N25接种的甜橙样品诱导产生6条酸性病程相关蛋白条带,CTV弱毒株系N4接种的甜橙诱导产生2条酸性蛋白条带。在接种的枳壳样品中未发现酸性病程相关蛋白条带的变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 文献综述
• 1.1 柑橘衰退病的危害
• 1.2 柑橘衰退病毒的生物学特性
• 1.2.1 柑橘衰退病毒的寄主范围
• 1.2.2 柑橘衰退病毒的传播方式
• 1.2.3 柑橘衰退病毒的株系分化
• 1.3 病原物与寄主互作过程中寄主的抗病反应
• 1.4 酶和可溶性蛋白在植物抵御病原物过程中的作用
• 1.4.1 同工酶概述
• 1.4.2 过氧化物酶、多酚氧化酶和酯酶在植物抗病过程中的作用
• 1.4.3 可溶性蛋白在植物抵御病原物过程中的作用
• 1.5 病程相关蛋白的相关研究
• 1.5.1 病程相关蛋白发生及其诱导因素
• 1.5.2 病程相关蛋白家族概况
• 1.5.3 病程相关蛋白与植物抗病性的关系
• 2 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 研究材料
• 3.1.1 柑橘材料
• 3.1.2 抗体来源
• 3.1.3 引物来源
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 TAS-ELISA检测
• 3.2.2 RT-RCR
• 3.2.2.1 核酸提取
• 3.2.2.2 RT-PCR
• 3.2.3 同工酶和可溶性蛋白的提取
• 3.2.3.1 同工酶的提取
• 3.2.3.2 可溶性蛋白的提取
• 3.2.4 酶活性测定和可溶性蛋白含量测定
• 3.2.4.1 POD活性测定
• 3.2.4.2 PPO活性测定
• 3.2.4.3 可溶性蛋白含量测定
• 3.2.5 同工酶谱测定
• 3.2.5.1 POD同工酶谱测定
• 3.2.5.2 PPO同工酶谱测定
• 3.2.5.3 EST同工酶谱测定
• 3.2.6 可溶性蛋白SDS-PAGE分析
• 3.2.7 酸性病程相关蛋白的制备及SDS-PAGE分析
• 4 结果及分析
• 4.1 CTV强毒及弱毒株系接种柑橘植株的病毒检测结果
• 4.1.1 接种柑橘样品中CTV的TAS-ELISA检测
• 4.1.2 接种CTV后枳壳样品病毒RT-PCR检测
• 4.2 CTV不同致病力株系接种柑橘后叶片POD和PPO活性变化
• 4.2.1 不同叶位柑橘叶片酶活性差异比较
• 4.2.2 CTV不同致病力株系接种对墨西哥莱檬叶片中POD和PPO活性影响
• 4.2.3 CTV不同致病力株系接种对甜橙样品POD和PPO活性影响
• 4.2.4 CTV不同致病力株系接种对枳壳样品POD和PPO活性影响
• 4.3 CTV不同致病力株系接种对柑橘叶片中同工酶表达谱的影响
• 4.3.1 CTV不同致病力株系接种对柑橘叶片中POD同工酶影响
• 4.3.2 CTV不同致病力株系接种柑橘叶片中PPO同工酶影响
• 4.3.3 CTV不同致病力株系接种对柑橘叶片中EST同工酶影响
• 4.4 CTV强毒株系接种墨西哥莱檬叶片中可溶性蛋白含量变化
• 4.5 CTV不同致病力株系接种柑橘叶片中可溶性蛋白SDS-PAGE结果
• 4.6 CTV不同致病力株系接种柑橘后叶片酸性病程相关蛋白的电泳分析
• 5 总结与讨论
• 5.1 不同寄主中CTV含量变化
• 5.2 CTV不同致病力株系接种对不同柑橘品种酶活性及其同工酶谱影响
• 5.3 CTV不同致病力株系接种不同柑橘品种可溶性蛋白的变化
• 5.4 CTV不同致病力株系接种不同柑橘品种酸性病程相关蛋白的变化
• 参考文献:
• 附 试验所用溶液的配制
• 致谢