胰岛素对牛脂肪细胞中脂联素及其受体mRNA表达的影响

论文摘要

本研究以荷斯坦新生公犊牛为实验材料,无菌采集腹股沟和附睾周围的脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化法和组织块培养法分离培养牛前脂肪细胞,通过对所培养的脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线绘制、胰岛素诱导分化、油红O染色及前脂肪细胞和成熟脂肪细胞标志基因检测,构建了牛前脂肪细胞体外增殖及分化模型。检测adiponectin、AdipoR1、AdipoR2、Pref-1和PPAR-γmRNA在牛前脂肪细胞分化过程中的表达规律。同时,以分化9 d的脂肪细胞为对象,研究了不同浓度和不同处理时间,胰岛素对adiponectin、AdipoR1和AdipoR2 mRNA表达的影响及可能影响的代谢通路。本研究初步揭示牛前脂肪细胞增殖和分化规律,探讨了脂联素及其受体基因在牛脂肪细胞增殖分化过程中的可能调控机制,为提高我国地方黄牛肌内脂肪含量奠定了基础。主要研究结果如下:1.初步构建了牛前体脂肪细胞体外增殖及分化模型用Ⅰ型胶原酶消化法可从新生牛脂肪组织中分离大量的前脂肪细胞,经胰岛素诱导分化、油红O染色和前脂肪细胞标志基因Pref-1和脂肪细胞标志基因PPAR-γ检测,体外分离培养的前脂肪细胞生长汇合后诱导9 d可分化成脂肪细胞。2.阐明了adiponectin、AdipoRs、Pref-1和PPAR-γ在牛脂肪细胞分化过程中的表达规律Adiponectin在牛前脂肪细胞中不表达,随前脂肪细胞的诱导分化adiponectin和AdipoR2 mRNA的表达显著增加（P<0.05）,AdipoR1在细胞分化过程中持续表达且表达水平变化不显著（P>0.05）。Pref-1 mRNA在前脂肪细胞中高表达随脂肪细胞分化显著降低,在8 d分化的细胞中不表达,同时,在诱导分化的细胞中Pref-1的表达显著低于正常培养的细胞（P<0.05）。PPAR-γ随前脂肪细胞分化表达增加,且在诱导分化的细胞中显著高于正常培养细胞（P<0.05）。3.研究了不同胰岛素浓度及处理时间对脂联素及其受体基因的表达变化诱导分化9 d的牛脂肪细胞中不同处理浓度胰岛素均能抑制adiponectin mRNA的表达且呈剂量依赖性抑制,同时,100 nmol/L呈时间依赖性抑制adiponectin的表达。不同浓度胰岛素均能抑制AdipoR2的表达而且各剂量的抑制效果差异不显著,100 nmol/L胰岛素处理24 h能显著抑制AdipoR2的表达。不同浓度胰岛素和胰岛素处理时间对AdipoR1的表达没有影响。4.初步揭示了牛脂肪细胞中胰岛素能通过PI3K/Akt信号通路抑制adiponectin和AdipoR2的转录,而且抑制是可逆的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 脂肪细胞分化的研究现状
• 1.1 前脂肪细胞的增殖及分化过程
• 1.2 脂肪细胞分化的研究模型
• 1.3 脂肪细胞分化调节
• 1.3.1 前脂肪细胞的克隆性增殖
• 1.3.2 前脂肪细胞分化过程中基因表达
• 1.3.3 糖皮质激素、胰岛素和胰岛素样生长因子对脂肪细胞分化的调节
• 1.3.4 肾上腺素受体信号的调节
• 1.4 脂肪细胞因子的研究进展
• 1.4.1 瘦素（Leptin）
• 1.4.2 脂联素（Adiponectin）
• 1.4.3 抵抗素（Resistin）
• 1.4.4 内脏脂肪素（Visfatin）
• 1.4.5 肿瘤坏死因子（TNF-α）
• 1.4.6 白介素-6（IL-6）
• 1.4.7 补体D（Adipsin）
• 1.4.8 纤溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）
• 1.5 脂滴在脂肪细胞中的角色
• 第二章 脂联素及其受体的研究现状
• 2.1 脂联素及受体的结构
• 2.1.1 脂联素结构及特征
• 2.1.2 脂联素受体的结构和特征
• 2.2 脂联素及受体基因的表达调控
• 2.2.1 脂联素基因的表达调控
• 2.2.2 脂联素受体基因的表达调控
• 2.3 脂联素及受体对脂肪代谢的调节
• 试验研究
• 前言
• 第三章 牛前体脂肪细胞的分离培养
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 实验动物
• 3.1.1.2 主要试剂
• 3.1.1.3 实验仪器及器械
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 主要溶液配制
• 3.1.2.2 酶消化法分离培养前脂肪细胞
• 3.1.2.3 组织块法培养前脂肪细胞
• 3.1.2.4 细胞生长曲线测定
• 3.1.2.5 细胞诱导分化
• 3.1.2.6 油红O 染色及细胞脂肪含量检测
• 3.1.2.7 检测标志基因的表达
• 3.1.3 数据统计
• 3.2 结果
• 3.2.1 酶消化分离前脂肪细胞
• 3.2.2 组织块法培养前脂肪细胞
• 3.2.3 牛前脂肪细胞生长曲线
• 3.2.4 油红O 染色及细胞脂肪含量检测
• 3.2.5 检测Pref-1 和PPAR-γ的表达
• 3.3 讨论
• 3.3.1 脂肪细胞体外培养是研究脂肪沉积有效模型
• 3.3.2 组织块法和酶消化法的比较
• 3.3.3 牛脂肪细胞的鉴定
• 第四章 脂联素及其受体在牛脂肪细胞分化过程中的表达
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 实验动物
• 4.1.1.2 主要试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 琼脂糖电泳有关试剂配制
• 4.1.2.2 实验设计
• 4.1.2.3 细胞总RNA 的提取
• 4.1.2.4 反转录
• 4.1.2.5 PCR 扩增
• 4.1.3 数据统计
• 4.2 结果
• 4.2.1 脂肪细胞中提取RNA 的完整性
• 4.2.2 循环数对平台期影响
• 4.2.3 脂联素在牛前脂肪细胞分化中的表达
• 4.2.4 AdipoR1 在牛前脂肪细胞分化中的表达
• 4.2.5 AdipoR2 在牛前脂肪细胞分化中的表达
• 4.2.6 Pref-1 在牛前脂肪细胞分化中的表达
• 4.2.7 PPAR-γ在牛前脂肪细胞分化中的表达
• 4.3 讨论
• 4.3.1 扩增循环数对基因表达定量的影响
• 4.3.2 adiponectin 和AdipoRs 在牛脂肪细胞分化过程中的表达
• 4.3.3 Pref-1 和PPAR-γ在牛脂肪细胞分化过程中的表达
• 第五章 胰岛素对牛脂肪细胞脂联素及受体m RNA 表达的影响
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 实验动物
• 5.1.1.2 主要试剂
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 相关试剂的配置
• 5.1.2.2 实验设计
• 5.1.2.3 细胞总RNA 的提取
• 5.1.2.4 半定量RT-PCR 分析
• 5.1.3 统计分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 不同浓度胰岛素对adiponectin 和AdipoRs mRNA 表达的影响
• 5.2.2 胰岛素处理时间对adiponectin 和AdipoRs mRNA 表达的影响
• 5.2.3 抑制P13K 和MAPK 通路对adiponectin 和AdipoR2 m RNA 表达的影响
• 5.2.4 胰岛素可逆性抑制adiponectin 和AdipoR2 m RNA 的表达
• 5.3 讨论
• 5.3.1 胰岛素浓度和处理时间对adiponectin 和AdipoRs mRNA 表达的影响
• 5.3.2 P13K 和MAPK 信号在adiponectin 和AdipoRs mRNA 表达中的作用
• 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介