二化螟Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N和钙粘蛋白基因的克隆及在昆虫细胞系的表达

论文摘要

二化螟Chilo suppressalis（Walker）是严重威胁我国水稻生产的重要害虫。近年来，受耕作制度和种植结构的改变、高产优质水稻品种的大面积种植、天气等原因的影响，二化螟的发生逐年加重，而且由于化学农药长期大量反复的使用，使其抗药性明显上升，更加难以防治。转Bt基因水稻的出现为防治二化螟提供了新的有效的方法，但是从生物学角度来看，昆虫对转基因作物产生抗性是一种胁迫进化现象。因此，研究Bt毒杀二化螟的机理、二化螟对Bt产生抗性的可能机制，可以为将米转基因水稻的推广、制定抗性治理策略、延长转基因水稻的使用期限等提供重要的理论依据。本论文研究了二化螟Bt毒素的主要受体—氨肽酶N（Aminopeptidase N，APN）和钙粘蛋白（Cadherin，CAD），利用PCR结合RACE技术的方法得到了二化螟中肠APN和钙粘蛋白基因的全长序列，并在昆虫杆状病毒表达系统中成功的进行了表达。主要结果如下：利用PCR结合RACE技术的方法得到了二化螟中肠氨基氨肽酶N基因的全长序列，同时利用PCR技术得到钙粘蛋白基因的全长序列。其中APN经数据库比对鉴定为氨肽酶N基因家族的1个成员，其基因全长已在GENEBANK登记，登录的序列号为：DQ342305，基因全长3292bp，编码1075个氨基酸，其C端有一段25个氨基酸组成的片段，具有亲脂性和跨膜特性；钙粘蛋白基因在GENEBANK登录的序列号为：DQ821523，基因全长5148bp，编码1715个氨基酸，有16个钙粘蛋白重复域，与欧洲玉米螟等其他鳞翅目昆虫钙粘蛋白具有较高的同源性，同源性达73％。昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一，已广泛应用于重组蛋白的表达。该系统具有许多优点，如多角体启动子控制下的高效表达，比较完善的转录后加工修饰，容易从细胞中纯化，无内毒素污染等。将APN和钙粘蛋白的基因克隆到Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTb中多角体基因启动子的下游，筛选出重组质粒pFastBacHTb／目的基因；并转化大肠杆菌DH10Bac，在体内进行重组，经抗性和蓝白斑筛选，获得杆状病毒重组载体Bacmid／目的基因；转染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞（Tn-5B1-4），获得含目的基因的重组杆状病毒，重组病毒感染Tn细胞后，得到表达的蛋白。经过SDS-PAGE分析和点杂交结果显示，APN和钙粘蛋白基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了表达，且均为Cry1Ab的受体蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 二化螟的危害及转基因水稻的发展
• 1.2 Bt毒素的杀虫机理
• 1.3 国内外Bt受体的研究进展
• 1.3.1 氨肽酶N（APN）
• 1.3.2 钙粘蛋白（Cadherin-like protein,CAD）
• 1.3.3 碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase,ALP）
• 1.3.4 肌动蛋白（Actin）
• 1.3.5 糖酯（Glycolipid）
• 1.4 RACE技术
• 1.5 昆虫杆状病毒表达系统
• 1.6 本论文研究的目的与意义
• 第二章 研究内容和技术路线
• 2.1 主要研究内容
• 2.1.1 克隆APN和CAD基因序列及序列分析
• 2.1.2 APN和CAD在Tn细胞系中的表达及功能鉴定
• 2.2 APN和CAD研究的技术路线
• 2.2.1 APN研究的技术路线（图2.1）
• 2.2.2 CAD研究的技术路线（图2.2）
• 第三章 APN基因的克隆及序列分析
• 3.1 试验材料和方法
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 细菌培养基
• 3.1.3 质粒DNA抽提液
• 3.1.4 琼脂糖凝胶电泳缓冲液
• 3.1.5 主要试剂
• 3.1.6 仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 RNA的提取
• 3.2.2 反转录
• 3.2.3 基因克隆引物设计
• 3.2.4 PCR产物的纯化回收
• 3.2.5 PCR纯化产物与T-EASY载体连接
• 3.2.6 转化
• 3.2.7 质粒DNA的提取
• 3.2.8 PCR鉴定
• 3.2.9 序列测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 APN基因的克隆、鉴定
• 3.3.2 序列结果与分析
• 3.4 讨论
• 第四 CAD基因的克隆及序列分析
• 4.1 试验材料和方法
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 RNA的提取
• 4.2.2 反转录合成
• 4.2.3 基因克隆引物设计:
• 4.2.4 PCR产物的纯化回收
• 4.2.5 PCR纯化产物与T-EASY载体连接
• 4.2.6 转化
• 4.2.7 质粒DNA的提取
• 4.2.8 PCR鉴定
• 4.2.9 序列测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 CAD基因的克隆、鉴定
• 4.3.2 核酸序列结果与分析
• 4.4 讨论
• 第五章 APN和CAD的表达及鉴定
• 5.1 材料和试剂
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 部分储存液配方
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 酶切重组和供体质粒
• 5.2.2 回收
• 5.2.3 APN回收产物酶切
• 5.2.4 回收
• 5.2.5 连接
• 5.2.5 转化
• 5.2.6 质粒DNA的提取
• 5.2.7 双酶切鉴定
• ac的制作'>5.2.8 DH10B_ac的制作
• ac'>5.2.9 转DH10B_ac
• 5.2.10 挑单菌落
• 5.2.11 提取重组DNA
• 5.2.12 PCR鉴定
• 5.2.13 共转染
• 5.2.14 Cry1Ab毒蛋白的纯化
• 5.2.15 蛋白鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 重组转移载体pFastBacHTb/APN和pFastBacHTb/CAD的构建
• 5.3.2 重组杆状病毒的鉴定
• 5.3.3 重组杆状病毒转染Tn细胞
• 5.3.4 APN、CAD基因在昆虫Tn细胞中的表达
• 5.4 讨论
• 第六章 主要结论
• 1.首次克隆了二化螟的APN基因序列
• 2.克隆了二化螟的CAD基因序列
• 3.利用杆状病毒昆虫表达系统表达APN和CAD
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历