生防细菌W1的种类鉴定及其抗菌蛋白的分离纯化与性质研究

论文摘要

W1是一株从扬州农田土壤中分离获得的生防细菌,其能产生抗菌蛋白,对植物病原菌有较好的拮抗作用。为了进一步研究利用该生防细菌,本论文对细菌的分类地位、抗菌蛋白分离纯化方法、抗菌蛋白理化性质以及抑菌特性进行了初步研究。对生防细菌W1进行了16S rDNA序列分析,结果显示该菌与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、莫哈韦芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和Bacillus velezensis五个种细菌的序列有较高的同源性,同源性分别为100%、99%、99%、98%和98%。W1菌株的表型特征为具有好氧性,能液化明胶,能利用丙酸盐,这些特征与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌类似。根据16S rDNA序列的相似性与生物学性状比较,W1菌株与解淀粉芽孢杆菌较为接近,因此初步将其定为解淀粉芽孢杆菌。W1菌株培养滤液中的抗菌蛋白可以30%硫酸铵完全沉淀,沉淀物经透析后得粗蛋白。粗蛋白经Sepharose Fast Flow离子交换柱层析在280nm处有四个吸收峰,其中峰D对供试病菌（棉花枯萎病菌Fsarium oxysporum f. sp. vasinfectum）具有明显的抑菌活性,且含量最高,其余峰均无抑菌活性。收集的峰D物质再经Sephadex G-75凝胶柱层析在280nm处有三个吸收峰,其中只有峰D-1具抑菌活性,含量最高。收集峰D-1即为精提蛋白。对精提蛋白进行SDS-PAGE,仅出现一条蛋白带。这表明用以上方法可以从W1培养滤液中提取到较纯的抗菌蛋白。经理化测定,生防细菌W1抗菌蛋白分子量为40,856Da,等电点为6.56;该蛋白中含有脯氨酸或羟脯氨酸,没有苯环结构,不含有脂基,但含糖基,含糖量达35.0%。提取的抗菌蛋白对棉花枯萎病菌具有明显的破坏菌丝形态和抑制生长的作用。对菌丝形态的破坏作用主要表现为菌丝原生质收缩、菌丝细胞膨大成泡囊状、细胞壁破裂和原生质外渗等,严重的导致菌丝不能继续生长,甚至完全崩解。这种破坏作用随处理时间延长和抗菌蛋白浓度加大而增强。抗菌蛋白能破坏菌丝细胞膜透性,导致细胞内电解质渗漏。经测定,抗菌蛋白对细胞膜的最大损伤率达4.19%。另外,抗菌蛋白对菌丝生长、分生孢子产生、萌发及芽管伸长均有显著的抑制作用,高浓度（200μg/ml）时,抑制率分别为89.34%、95.24%、96.38%和99.91%。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、植物病害生防微生物种类
• （一） 生防细菌
• （二） 生防放线菌
• （三） 生防真菌
• （四） 其他生防微生物
• 二、芽孢杆菌类生防细菌研究进展
• （一） 芽孢杆菌抗菌性次生代谢产物
• （二） 芽孢杆菌抗菌蛋白
• （三） 抗菌蛋白纯化方法
• （四） 芽孢杆菌抗菌蛋白基因
• （五） 芽孢杆菌在生物防治中的应用
• 三、细菌的种类鉴定
• （一） 芽孢杆菌属的分类特征
• （二） 芽孢杆菌的种类鉴定
• 四、本研究目的和意义
• 材料与方法
• 一、供试菌株
• 二、培养基与缓冲液配制
• 三、主要试剂及仪器
• （一） 主要试剂
• （二） 主要仪器
• 四、生防菌种类鉴定
• （一） 分子生物学方法鉴定
• 1. CTAB 法提取细菌总基因组 DNA
• 2. 16S rDNA 的扩增及测序
• （二） 形态特征观察
• 1. 透射电镜观察
• 2. 芽孢染色
• 3. 培养特征观察
• （三） 生理生化特征
• 1. 革兰氏染色
• 2. 需氧性测定
• 3. 柠檬酸盐利用试验
• 4. 接触酶试验
• 5. V-P 试验
• 6. 硝酸盐还原试验
• 7. 淀粉水解
• 8. 明胶液化
• 2S产生试验'>9. H₂S产生试验
• 10. 丙酸盐利用
• 五、抗菌蛋白的分离与纯化
• （一） 硫酸铵盐析
• （二） 脱盐
• 1. 透析袋预处理
• 2. 样品浓缩
• 3. 样品脱盐
• （三） Sepharose Fast Flow 离子交换与Sephadex G-75 凝胶柱层析
• 1. 凝胶预处理
• 2. 装柱
• 3. 上样
• 4. 洗脱与检测
• 5. 胶体的再生和保存
• （四） 样品蛋白质含量的测定
• 六、抗菌蛋白理化性质研究
• （一） 抗菌蛋白组成测定
• 1. 茚三酮反应
• 2. 油红-O 染色液的显色反应
• 3. 蒽酮反应
• 4. 硝酸反应
• 5. 双缩脲反应
• （二） 抗菌蛋白含糖量测定
• （三） 抗菌蛋白分子量测定
• 1. 电泳缓冲液的配制
• 2. 样品的处理
• 3. 凝胶的配制
• 4. 低分子量标准蛋白质
• 5. 电泳条件
• 6. 凝胶板剥离
• 7. 染色与脱色
• 8. 分子量计算
• （四） 抗菌蛋白等电点测定
• 1. 溶液的配制
• 2. 电极缓冲液的配制
• 3. 凝胶的配制及加样
• 4. 灌胶
• 5. 电泳
• 6. 剥胶
• 7. 固定
• 8. 测定
• 9. pH 标准曲线的制作
• 10. pI 计算
• 七、抗菌蛋白对棉花枯萎病菌的抑制活性测定
• （一） 对病菌菌丝生长的抑制作用测定
• （二） 对病菌菌丝细胞破坏作用的测定
• 1. 对菌丝形态破坏的观察
• 2. 菌丝相对电导率测定
• （三） 对分生孢子产生、萌发和芽管生长的抑制作用测定
• 结果与分析
• 一、生防细菌种类鉴定
• （一） 16SrDNA 序列分析
• （二） 形态特征
• （三） 生理生化特征
• 1. 培养性状
• 2. 生理生化反应
• 二、抗菌蛋白的分离与纯化
• （一） 粗提蛋白及其抑菌活性
• （二） 精提蛋白及其抑菌活性
• 1. Sepharose Fast Flow 离子交换层析
• 2. Sephadex G-75 凝胶层析
• （三） 抗菌蛋白浓度
• 三、抗菌蛋白理化性质
• （一） 抗菌蛋白分子量
• （二） 抗菌蛋白等电点
• （三） 抗菌蛋白组成分析
• 1. 肽键测定（双缩脲反应）
• 2. α-氨基酸测定（茚三酮反应）
• 3. 芳香族氨基酸测定（硝酸反应）
• 4. 脂类物质测定（油红-O 染色液的显色反应）
• 5. 糖基测定（蒽酮反应以及含糖量）
• 四、抗菌蛋白对棉花枯萎病菌的抑制作用
• （一） 对菌丝生长的抑制
• 1. 对菌丝形态的破坏
• 2. 对菌丝细胞膜的破坏
• （二） 对菌丝细胞的破坏作用
• （三） 对分生孢子产生、萌发和芽管生长的抑制
• 讨论
• 一、生防细菌种类
• 二、抗菌蛋白的分离纯化与理化性质
• 三、抗菌蛋白对棉花枯萎病菌的抑制
• 四、生防细菌及其抗菌蛋白的应用前景
• 参考文献
• 致谢