初级感觉神经元动作电位时空可塑性的离子通道机制 ——病理痛信号的空间编码？

论文摘要

神经系统可以对来自内、外环境的信息进行转化、编码、整合、储存和传递,这些过程主要是通过“全或无”的动作电位以规则或不规则放电的形式在神经纤维上的传导和突触之间的传递实现的。通常将动作电位大小不随刺激强度和传导距离而发生改变现象称作“全或无”,这一特性可以保证信息的精确性。目前,对动作电位串编码的方式虽然有多种学说,例如平均频率编码（meanrate code ）、群体编码（population code ）、时间编码（temporal code ）、模式编码（pattern code ）等等,但是关于动作电位串的模式与神经信息的确切关系问题一直存在着争论。最近的研究表明:大脑皮层神经元活动模式可能不是利用精确的活动模式来进行信息编码的。这对当前关于神经元节律编码信息的观点产生了极大的影响。是否存在节律编码以外的信息传递方式呢?对此,我们知之甚少。伤害性信息通常被认为是在初级感觉神经元和终末的伤害性感受器激活后形成的动作电位串,可以将危害机体的刺激信息（模式、强度、时程）进行初级编码,然后以一定时间序列沿着躯体感觉神经纤维的中枢突向脊髓传递。与经典的动作电位不同,由于离子通道的多样性和多态性、特异性的离子通道阻断剂的缺乏以及离子通道活性调节的多因素性,伤害性感受器动作电位产生机制以及在病理性痛中的作用不甚清晰。更为重要的是,由于长期受到“全或无”动作电位编码信息理论的影响,目前对于病理过程中的单个动作电位时空参数（尤其是幅度和去极化时程）是否发生改变及其功能意义研究甚少。本课题主要运用膜片钳技术,通过记录和分析痛觉信息传递的第一级神经元（DRG神经元）动作电位的空间参数（幅度）和时间参数（去极化时程和复极化时程）,从离体细胞水平和在体水平两个层次上,分别研究神经元周围钙离子的稳态失衡和炎性病理性痛状态下,DRG神经元动作电位时空参数的变化特征。为了探讨动作电位产生与可塑性的离子通道机理,我们进一步研究了两种TTX-R钠通道（NaV1.8和NaV1.9）在动作电位时空可塑性中的作用及功能意义。通过对神经元单个动作电位时空参数的研究,我们得到以下结果:1.初级感觉神经元动作电位不仅具有时间可塑性,还有空间可塑性在没有外在刺激因素的状态下,自发放电的背根节（DRG）神经元所产生动作电位具有“全或无”的特征,其时间参数和空间参数相同。向DRG神经元内连续10次注入相同的电流（强度300 pA,间期:3 ms,间隔200 ms）,所产生的动作电位具有“全或无”的特征,而向同一神经元内连续10次注入不同强度的电刺激（强度50-500 pA,50 pA递增）,所产生的动作电位波形完全不同。为了进一步研究电刺激诱发动作电位的特性,我们采用了以下的电刺激参数:强度50-500 pA,每次递增50 pA,共10串电刺激,每串电刺激的波宽0.5-5 ms,每次递增0.5 ms,每个电刺激时间间隔200 ms,电刺激总计数100个。结果显示出以下特点:第一,动作电位的幅度在一定时间参数上不随电刺激波宽的增加而改变,但随电刺激强度的增加而增强。第二,动作电位的时程在同一阈上刺激强度时随电刺激波宽的增加而先缩短后恢复,但在同一波宽却随电刺激强度的增加而缩短。第三,动作电位的去极化时程在同一阈上刺激强度时不随电刺激波宽的增加而改变,但随电刺激强度的增加而缩短。第四,动作电位的复极化时程在同一阈上刺激强度时随电刺激波宽的增加而先缩短后恢复,但在同一波宽却随电刺激强度的增加而缩短。这些结果说明:初级感觉神经元动作电位具有时空可塑性。这种可塑性与电刺激参数有关,刺激电流的强度主要影响动作电位的幅度和去极化时程,而刺激电流波宽主要影响复极化时程。2.细胞内外钙离子稳态的维持有利于初级感觉神经元动作电位保持‘全或无’的时空特征1)细胞外钙离子浓度改变对DRG神经元动作电位的影响。形成全细胞模式后,依次将细胞外的钙离子调整为（mM）:2.5 Ca,0 Ca,1 Ca, 5 Ca和10 Ca,分别记录电刺激（参数:强度500 pA,波宽3 ms）诱发的动作电位。其中0 Ca条件对动作电位的波形影响最大,可以使DRG神经元动作电位的幅度明显降低,复极化时程显著延长,而对去极化时程没有明显影响。由于细胞外0 Ca时, DRG神经元静息膜电位向去极化方向移动约10 mV,所以0 Ca条件对动作电位时空参数的影响可能是通过对膜电位的影响而实现的。在5 Ca和10 Ca条件下,除去极化时程显著延长外,其他参数没有显著变化。2)细胞内钙离子浓度降低对DRG神经元动作电位的影响。用0 Ca外液和thapsigargin（Tg,1μM ）共同孵育神经元15 min后,排空细胞内钙离子,记录电刺激（参数:强度500 pA,波宽3 ms）诱发的动作电位。结果显示:细胞内钙离子降低后,可以使DRG神经元产生的动作电位的幅度降低,总时程和复极化时程显著延长,而去极化时程没有明显改变。3)细胞内钙离子浓度升高对DRG神经元动作电位时空参数的影响首先,运用钙离子成像和膜片钳同步记录技术,确定辣椒素（capsaicin）诱发的钙离子升高持续时间、反应幅度以及神经元膜电位和内向电流变化时程等参数。Capsaicin（0.5μM, 10 s）诱发的钙离子浓度增加的峰值出现在给药后10 s,神经元内钙离子升高反应可以持续120 s以上,而内向电流和膜电位在30 s时,已经基本恢复到初始水平。IP3受体阻断剂2-APB（50μM）不能阻断capsaicin诱发的反应,而ryanodine受体阻断剂钌红（Ruthenium Red,RR）10μM可以完全阻断capsaicin诱发的钙离子升高反应,对内向电流也有显著的抑制作用。继而,我们分别记录capsaicin之前和停药30 s后,电刺（参数:强度500 pA,波宽3 ms）激诱发的动作电位,结果显示:细胞内钙离子升高可以使动作电位的幅度显著降低,而对去极化时程和复极化时程均没有影响。3.外周炎症条件刺激可以改变初级感觉神经元动作电位的时空特性前面的研究已经表明:细胞水平的钙离子稳态失衡可以引起动作电位的可塑性变化。那么在个体处于病理状态下,动作电位是否会发生变化?其意义如何呢?我们进一步运用炎性病理性痛模型,研究病理条件下动作电位的时空特性。1)行为学试验表明,大鼠足底注射CFA（100μl,溶于生理盐水）1天或蜜蜂毒肽melittin （100μg/100μl,溶于生理盐水）2 h后,热刺激缩足反应潜伏期（PWTL）和机械刺激阈值（PWMT）均显著降低。在体电生理记录表明,CFA或melittin致炎处理后,伤害性热刺激（49℃水浴）以及毛刷（brush）、触压（pressure）和钳夹（pinch）等机械刺激诱发的脊髓背角广动力域（WDR）神经元放电反应均显著增强。这些结果说明,CFA和melittin足底注射可以诱发炎性痛反应。2)CFA和melittin致炎处理对DRG神经元兴奋性的影响。通过足底注射荧光指示剂DiI （ 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,17 mg/ml,溶于10% DMSO）,我们可以鉴定出支配大鼠后肢足底的两类DRG神经元（即phasic神经元和tonic神经元）。结果显示:CFA和melittin致炎处理对两类DRG神经元兴奋性的影响不同,tonic神经元可以通过降低动作电位阈值和增加放电个数而提高神经元的兴奋性,而phasic神经元的兴奋性并未发生显著改变。结果提示:在炎性病理性痛状态下,伤害性信息可能同时以节律编码和非节律编码的方式进行传递。3)CFA和melittin致炎处理对两类DRG神经元动作电位时空参数的影响。通过比较CFA或melittin致炎处理前后,相同的电流刺激（强度50-500 pA,波宽3 ms,时间间隔200 ms）诱发动作电位的波形,结果显示:tonic神经元的波形发生显著性改变,电刺激下动作电位的幅度和超射值显著增加,去极化时程和复极化时程均显著缩短。而phasic神经元动作电位波形的改变稍有不同:CFA致炎处理后phasic神经元动作电位的幅度和超射值显著增加,去极化时程和复极化时程均显著缩短,而melittin致炎处理后,phasic神经元动作电位的幅度和超射值显著增加,复极化时程显著缩短,但去极化时程没有明显变化。结果提示:除了上述神经元兴奋性改变以外,在炎性病理性痛状态下,DRG神经元动作电位的波形也可以发生显著变化,而这种改变可能是一种新的神经元可塑性的表现。4)炎性病理性痛条件下,动作电位时空可塑性变化可能与TTX-R钠通道相关。在正常状态下,给予相同的电流刺激（强度50-500 pA,50 pA递增,波宽3 ms,时间间隔200 ms）诱发动作电位,TTX（1μM）可以使DRG神经元的动作电位去极化时程明显延长,幅度明显减小。而大鼠足底注射CFA （100μl） 1天或melittin （100μg/100μl）2小时后,TTX的对动作电位幅度和去极化时程的影响明显减弱了。结果提示:外周致炎处理后,形成动作电位的上升支和去极化时程的TTX-R钠电流成分显著增加。4. TTX非敏感钠通道表达上调是导致初级感觉神经元动作电位空间可塑性的离子通道机制1)免疫组织化学结果显示:正常情况下,大鼠NaV1.8主要表达在中小直径神经元,而NaV1.9仅在小直径神经元有表达。CFA或melittin致炎后,NaV1.8阳性神经元平均计数分别增加了93%和50%,NaV1.9阳性神经元平均计数分别增加了74%和47%。2)Western blot结果显示:正常情况下,大鼠DRG神经元中NaV1.8和NaV1.9蛋白低表达。CFA处理组和melittin处理组中NaV1.8蛋白分别增加了84.25%和55.06%,而NaV1.9蛋白分别增加了51.97%和37.64%。3)RT-PCR结果显示:正常情况下,大鼠DRG神经元中NaV1.8和NaV1.9的处于低水平表达。CFA或melittin处理后NaV1.8的基因水平分别增加了116.02%和82.01%,而NaV1.9分别增加了87.86%和43.36%。4)膜片钳记录TTX-R钠电流的结果显示:大鼠足底注射CFA （100μl） 1天或melittin （100μg/100μl）2小时后,NaV1.8钠电流和NaV1.9钠电流均显著增加。将上述结果与TTX的药理学作用相结合,可以提示:在炎性病理性痛状态下,TTX-R钠通道NaV1.8和NaV1.9基因和蛋白的表达上调和功能易化是引起DRG神经元动作电位空间可塑性的主要原因。5.初级感觉神经元动作电位空间可塑性的病理意义1)免疫组织化学和western blot的结果显示:鞘内给予羧基荧光素（Carboxyfluorescein,FAM）标记的NaV1.8或NaV1.9反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,AS OND）连续3天（45μg/次,2次/天）,可以显著抑制CFA （100μl, 1d后）或melittin （100μg/100μl, 2 h后）引起的NaV1.8和NaV1.9阳性神经元的数量的增加和蛋白表达的上调。结果表明:反义寡核苷酸处理可以显著抑制炎性处理引起的蛋白表达增加反应。2)行为学检测结果显示:鞘内给予NaV1.8 AS或NaV1.9 AS（连续3天,45μg/次,2次/天）,对CFA （100μl, 1天后）或melittin （100μg/100μl,2 h后）诱发的炎性痛反应具有不同的作用。其中,NaV1.8 AS可以显著抑制CFA诱发的热痛敏和机械性痛敏,但对melittin诱发的热痛敏和机械性痛敏均没有明显影响。NaV1.9 AS对CFA诱发的热痛敏和机械性痛敏均没有明显影响,但可以显著抑制melittin诱发的热痛敏。这些结果提示:NaV1.8钠通道主要参与CFA诱发的慢性炎性热痛敏和机械性痛敏;而NaV1.9钠通道主要参与melittin诱发的急性炎性热痛敏。3)膜片钳记录显示:鞘内给予NaV1.8 AS或NaV1.9 AS（连续3天,45μg/次,2次/天）,对CFA （100μl, 1天后）或melittin （100μg/100μl, 2 h后）两种不同炎性痛状态下,DRG神经元的动作电位时空参数的影响不同。其中,NaV1.8 AS可以显著抑制CFA处理组动作电位的幅度,延长去极化时程,而NaV1.9 AS对CFA处理组动作电位的波形影响不大。相反,NaV1.8 AS对melittin处理组动作电位的波形影响不大,而NaV1.9 AS对melittin处理组动作电位的波形有一定程度的影响,主要表现在动作电位的幅度降低,去极化时程缩短。上述结果说明:DRG神经元动作电位空间可塑性变化具有不同的分子基础,并且与不同的炎性病理性痛的状态密切相关。经过慢性致炎物质CFA处理后,NaV1.8钠通道通过影响动作电位的幅度而引起痛敏表现;而经过急性致炎物质melittin处理后,NaV1.9钠通道通过影响动作电位的幅度而引起痛敏表现。结论1、在某些条件下（如自发放电或接受恒定刺激）,神经元动作电位具有“全或无”的时空特性,但是当刺激强度发生变化时,动作电位的空间参数（幅度）和时间参数（去极化和复极化时程）均可以发生显著变化,表明初级感觉神经元动作电位不仅具有时间可塑性,还有空间可塑性。2、神经元周围钙离子稳态失衡可以通过直接或间接（膜电位）作用降低动作电位的幅度,一定程度地延长动作电位的时程,表明细胞内外钙离子稳态的维持有利于初级感觉神经元动作电位保持‘全或无’的时空特征。3、在炎性病理性痛状态下,两类DRG神经元的动作电位的时空参数均发生可塑性变化。tonic神经元可能通过降低动作电位阈值和提高放电频率来提高兴奋性,参与伤害性信息传递,而phasic神经元的兴奋性并未发生显著变化,可能是通过幅度增大、时程缩短的动作电位来传递伤害性信息的。4、在炎性病理性痛状态下,TTX-R钠通道NaV1.8和NaV1.9基因和蛋白表达上调和功能易化是初级感觉神经元动作电位时空可塑性的主要原因。5、初级感觉神经元动作电位空间可塑性具有不同的分子基础,并且与不同的炎性病理性痛的状态密切相关。其中,NaV1.8钠通道表达异常引起的动作电位空间可塑性的变化与CFA诱发的慢性炎性热痛敏和机械性痛敏的发生密切相关,而NaV1.9钠通道表达异常引起的动作电位空间可塑性变化与melittin诱发的急性炎性热痛敏的发生密切相关。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言和文献回顾
• 第一部分 初级感觉神经元动作电位不仅具有时间可塑性，还有空间可塑性
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果（一）
• 第二部分 细胞内外钙离子稳态的维持有利于初级感觉神经元动作电位保持‘全或无’的时空特征
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果（二）
• 第三部分 外周炎症条件刺激可以改变初级感觉神经元动作电位的时空特性：空间可塑性是否是编码病理痛信号的新模式？
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果（三）
• 第四部分 TTX非敏感钠通道表达上调是导致初级感觉神经元动作电位空间可塑性的离子通道机制
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果（四）
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢