水稻胚胎发生相关基因的表达及其功能鉴定

论文摘要

高等植物在漫长的进化过程中有着不同的分化方向,单、双子叶植物在双受精后的胚胎发生过程中产生了不同的发生模式。近年来,尽管人们以拟南芥为材料,通过大量突变体及转录因子的研究,对植物胚胎发生的分子基础有了比较深入的认识,但对单子叶植物胚发育的机制了解甚少。本研究利用水稻作为研究材料,通过对与拟南芥胚胎发生关键基因高度同源水稻cDNA序列的半定量RT-PCR分析,初步确认水稻胚胎发生相关基因的时空表达模式。在此基础上,以WOX类转录因子为研究重点,对OsWOX2、OsWOX4基因的表达及功能进行了分析,以研究它们在水稻胚胎发生过程中的作用。主要结果如下:1.通过半定量RT-PCR及原位杂交分析,我们分析了12类水稻胚胎发生相关基因的表达,发现单、双子叶植物胚胎发生关键基因的表达模式具有较高的相似性,说明它们在漫长的进化过程中可能起到功能相似的作用。同时,与拟南芥中已有资料相似,水稻胚胎发生过程中重要基因的表达多数受到生长素调节,说明生长素信号在单子叶植物的胚胎模式建成过程中同样起到了重要的作用。2.水稻基因组中共有12个WUSCHEL related homebox（WOX）开放阅读框,同源性比较分析发现,水稻WOX基因家族成员编码的蛋白含有保守的HD结构域及下游WUS-Box氨基酸残基,OsWOX homeodomain（HD）保守域与WUS蛋白HD保守区域的同源性分别达到36.36%到77.27%,聚类分析结果发现OsWOX与单子叶植物玉米、短柄草WOX类基因具有较近的亲缘关系。通过半定量RT-PCR和原位杂交分析,发现水稻WOX基因家族成员皆在细胞活动旺盛的区域表达。3. OsWOX2蛋白HD保守域与拟南芥WUS蛋白HD保守域的同源性为66.67%,与WOX2蛋白HD保守域的同源性为73.85%。亚细胞定位发现,OsWOX2-GFP蛋白在整个洋葱细胞中均有信号。OsWOX2基因主要在水稻幼嫩组织中细胞分裂旺盛的区域表达,在发育早期的胚、茎端分生组织和根端分生组织干细胞以外区域、叶原基、茎居间分生组织及幼嫩花器官中均可检测到OsWOX2基因mRNA的大量积累,当器官逐渐发育成熟时,OsWOX2基因的表达水平则逐渐降低。抑制OsWOX2基因的表达引起转基因植株株型矮化;叶中泡状细胞发育异常导致叶片基部严重皱褶;成熟叶片较野生型叶片宽大,叶脉紊乱且数目增多;叶鞘抱茎松散,单蘖高节位休眠芽继续发育,导致多次分蘖的产生;穗的各级枝梗分化没有明显变化,花器官数目正常,但雌、雄配子体发育受到严重影响,表现出严重的不育现象。转基因植株中OsWOX2基因的表达水平均有不同程度的降低。OsWOX2基因抑制表达植株影响了水稻叶片的形态发生,促进了水稻茎居间分生组织的活动,且抑制了花器官的正常发育过程。4. OsWOX4蛋白homeodomain（HD）保守域与拟南芥、玉米HD保守域的同源性高达80.00%。OsWOX4基因在除茎端分生组织L2层细胞以外细胞活动旺盛的根尖、茎端分生组织、幼胚、幼叶及幼嫩花序中表达,而且在成熟胚的茎端分生组织及根端分生组织中有较强的mRNA的积累。OsWOX4基因抑制表达植株的株高较野生型矮,叶片短窄,小穗数量减少,而且种子中胚乳的积累变少。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 胚胎发生过程概述
• 1.1.1 胚胎的早期发育过程
• 1.1.2 胚胎发育过程中的极性轴建立
• 1.1.2.1 顶-基轴的模式建成
• 1.1.2.2 其它对称模式的建成
• 1.1.3 顶端分生组织的形成与发育
• 1.1.3.1 茎端分生组织的形成及发育
• 1.1.3.1.1 茎端分生组织的形成及分类
• 1.1.3.1.2 双子叶植物茎端分生组织发育的调控
• 1.1.3.1.3 单子叶植物茎端分生组织发育的调控
• 1.1.3.2 根端分生组织的形成及发育
• 1.2 WOX 基因家族成员在胚胎发生过程中的作用
• 1.2.1 WOX 类基因的发现及序列特征
• 1.2.2 WOX 类蛋白间的进化关系
• 1.2.3 WOX 基因在胚胎发生过程中的作用
• 1.2.3.1 WOX 基因在胚胎发育早期中的作用
• 1.2.3.2 WOX 基因在早期胚胎发生过程中对极性轴建立的作用
• 1.2.3.3 WOX 基因在胚胎发生过程中对区域建成的作用
• 1.2.3.4 WOX 基因对顶端分生组织及其侧生器官发生的作用
• 1.2.3.4.1 WOX 基因在茎端分生组织发生及侧生器官形成中的作用
• 1.2.3.4.2 WOX 基因在根端分生组织发生中的作用
• 1.2.4 WOX 类转录因子与其它基因间的互作关系
• 1.2.4.1 分生组织形成及干细胞的维持
• 1.2.4.2 拟南芥胚胎区域建成中WOX9 与MP 和BDL 基因的关系
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料及其生长条件
• 2.2 菌株与载体
• 2.3 酶及生化试剂
• 2.4 目的基因的获得及表达分析
• 2.4.1 目的基因的获得
• 2.4.2 目的基因的表达分析
• 2.5 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 2.5.1 水稻成熟胚盾片愈伤组织的培养
• 2.5.2 愈伤组织的预培养及农杆菌的活化
• 2.5.3 农杆菌对水稻愈伤组织的转化
• 2.6 定量PCR
• 2.7 组织切片
• 2.7.1 取材固定
• 2.7.2 脱水、透明、浸蜡、包埋
• 2.7.3 切片
• 2.7.4 Toludine Blue O（TBO）染色
• 2.8 原位杂交
• 2.8.1 材料的固定
• 2.8.2 材料的包埋
• 2.8.3 切片
• 2.8.4 探针标记
• 2.8.4.1 探针模板的制备
• 2.8.4.2 探针模板线性化
• 2.8.4.3 转录反应
• 2.8.4.4 探针半定量
• 2.8.4.5 脱蜡、消化、乙酰化和杂交
• 2.8.4.6 洗片
• 2.8.4.7 检测
• 2.9 亚细胞定位及GFP 观察
• 2.9.1 材料准备
• 2.9.2 基因枪微弹的准备
• 2.9.3 基因枪转化洋葱表皮
• 2.10 GUS 染色
• 2.11 Tail-PCR 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻胚胎发育相关基因的表达分析
• 3.1.1 水稻胚胎发育相关基因的时空表达模式
• 3.1.2 水稻胚胎发生相关基因的表达对生长素的响应
• 3.2 WOX 类转录因子的分离与转基因材料的获得
• 3.2.1 WOX 类基因的克隆与序列分析
• 3.2.2 遗传转化材料的获得
• 3.2.2.1 过表达转化载体的构建
• 3.2.2.2 抑制表达载体的构建
• 3.2.2.3 农杆菌介导的遗传转化
• 3.3 转基因材料分析与WOX 类转录因子的功能研究
• 3.3.1 OsWOX2 基因在水稻叶片、分蘖和花发育方面的功能研究
• 3.3.1.1 OsWOX2 基因的时空表达模式
• 3.3.1.2 转pOsWOX2::GUS 载体植株GUS 染色分析
• 3.3.1.3 OsWOX2 的亚细胞定位
• 3.3.1.4 OsWOX2 基因抑制表达载体转基因材料分析
• 3.3.1.4.1 转基因植株生长势、叶片形态及分蘖的变化
• 3.3.1.4.2 转基因植株花器官的发育
• 3.3.1.4.3 转基因植株的RT-PCR 分析
• 3.3.1.4.4 转基因植株的Tail-PCR 分析
• 3.3.1.5 OsWOX2 基因过表达载体转基因材料分析
• 3.3.2 其它OsWOX 基因的表达及转基因材料表型观察
• 4 讨论
• 4.1 胚胎发生相关基因的表达在不同物种间存在一定的差异
• 4.1.1 水稻胚胎发生相关基因与不同物种同源基因的表达差异
• 4.1.2 水稻WUS-related homeobox 基因与其它物种同源基因间的表达差异
• 4.2 WOX 基因家族在被子植物类群中是一类古老的分枝
• 4.3 水稻OsWOX2 基因在水稻发育过程中起重要作用
• 5 结论
• 参考文献
• 附录1：部分实验操作流程
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文