基于几种色谱分析方法的生物样本的代谢组学研究

论文摘要

代谢组学又称代谢物组学,是研究机体代谢产物谱变化的一种新的系统方法。作为一种“组学”科学,它借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术,分析细胞、组织和其它生物样本如血液或尿液中内源性代谢物整体组成（Metabolome）并通过其复杂的、动态的变化来辩识和解析被研究对象的生理病理状态。代谢物组是蛋白质组、转录组和基因组总体表达的结果,直接反映组织的生化状态,能够较灵敏地刻画生命体生理病理状态的变化,对于阐明生命复杂系统具有极为重要的意义。其最主要的特征就是高通量的实验和大规模的计算,从系统生物学的角度出发,全面地综合地考察代谢变化。作为崭新的方法学,代谢组学已成为国际上疾病与健康研究的一个重要热点。因此用代谢组学的方法来研究复杂疾病包括代谢性疾病（如肥胖）,对于疾病的早期诊断、预防、药物干预具有重要的指导意义,而代谢组学研究必须要有高通量、高灵敏度与高精确度的分析技术来支撑,对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴定是代谢组学研究的重要步骤,也是变化最复杂最难控制从而导致分析结果难以重现的关键所在。与原有的各种组学技术只分析特定类型的物质不同,代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大,必须要对它们进行无偏向的全面分析,采用传统的分析方法依靠单一待定组分的已知性质获取信息,有以下局限性:（Ⅰ）样品处理方法复杂耗费人力;（Ⅱ）步骤多,方法多特异性,每种只适用于几种组分;（Ⅲ）代谢物降解造成假相,重现性差;（Ⅳ）不能满足样品的通过速率;（Ⅴ）不能测出协同效应。核磁共振（NMR）较早地被运用到代谢组学研究,但是NMR的缺点是灵敏度较低,有可能形成信号重叠,且其对样品制备的要求很高,在发展成为高通量的分析方法时,受到局限。同时因为动态范围有限,很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物。由于体液中所含组分众多,得到的核磁谱图往往很复杂,单独采用NMR很难对复杂的产物组分进行指认,因此,需要将NMR分析手段与其他各种色谱技术进行联用,方能成为药物代谢物组学研究的强大的手段。同时其灵敏度比MS差,所需进样量相对较大,因此体液中的很多痕量组分往往可能检测不到,而色谱是最常用和有效的分离分析工具,其与质谱的联用则可以完成从成分分离到鉴定的一整套工作。因此建立适用于代谢组学研究的色谱分离分析方法具有可行性和迫切性。本文从生物样本的前处理方法入手,确定了切实可行的样本前处理方法,通过一系列方法学研究建立适用于代谢组学研究的GC/MS、LC/MS和pCEC分离分析技术,以尿液为研究对象,进行代谢组学分析,结合PCA,PLS-DA,OPLS-DA等模式识别技术解决大量色谱峰的识别和代谢变化的趋势分析,同时将该方法用于检测高脂饲料诱导的肥胖大鼠自身代谢的变化,考察本论文建立方法的适用性和准确性,得到了重现性好、稳定、特征性显著的代谢组学图谱,为进一步研究奠定了基础。研究结果如下:1.建立了生物样本的前处理方法。在生物样本（本文主要是指尿液）中影响最大的是蛋白质,若用色谱法测定时,蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞,严重影响分离效果。本文通过实验筛选建立了尿液的前处理方法。首先将尿液在14000rpm下离心沉淀蛋白、浓缩富集直接用于LC/MS的测定,离心之后所得上清液用衍生化试剂氯甲酸乙酯（ECF）衍生,直接进行GC/MS和pCEC分析。结果表明,建立的尿液前处理方法简单、方便,适合大批量尿液的处理。2.建立了适合代谢组学研究的GC/MS测定方法。首先通过实验确定了尿液样品的处理方法及测试条件（包括尿液样本的各种不同处理方法的筛选,衍生化处理过程中尿液样本用量的选择、衍生化试剂的选择、前处理方法中催化剂的选择、衍生化条件的选择、GC/MS升温程序的优化等）,建立了用于代谢组学研究的GC/MS测定方法,方法学研究表明建立的方法重复性好、灵敏度高,精确度高,适用于快速的高通量检测。采用建立的GC/MS方法测定不同时间点对照组与高脂饲料诱导大鼠的尿液。采用优化的方法,检测到了约200～250个尿样代谢物,通过谱库检索和采用标准品比对确定了其中的80多个代谢物。得到的原始数据首先经过XCMS软件处理,利用Matlab software 7.0和SIMCA-P11.0等统计软件而建立的多维数据处理和计算方法,进行PCA分析,通过PCA得分图可以清楚地区分开对照组大鼠与高脂饲料诱导大鼠的代谢物的区别,说明用代谢组学方法可以区分出两种不同饮食动物的代谢物谱差异。采用OPLS-DA进行进一步的数据处理,由OPLS-DA分析结果可以直观的看出尿液中内源性代谢物含量发生的变化,尿液中代谢物的升高或降低揭示了与此相关的代谢途径发生的变化。3.首次将pCEC技术应用到代谢组学研究中,建立了适合于代谢组学研究的pCEC测定方法。通过实验确定了尿液样品的处理方法及测试条件（包括尿液样本用量的选择、衍生化试剂的选择、前处理方法中催化剂的选择、衍生化条件的选择、以及pCEC测试条件如检测波长、酸溶液种类、酸改性剂浓度、流动相组成、操作电压、梯度洗脱条件的优化等）,建立了用于代谢组学研究的pCEC测定方法,方法学研究表明建立的方法重复性好、灵敏度高,适用于快速的高通量检测。采用建立的pCEC方法分析了不同时间点对照组大鼠与高脂饲料诱导大鼠的代谢特征。采用优化的方法,检测到了约100个尿样代谢物,通过标准品比对确定了其中变化差异明显的8个代谢物。从pCEC图谱就可以直观的看出对照组大鼠与喂食高脂饲料肥胖大鼠代谢物发生了显著的变化（包括8个确定的代谢物与7个没有定性的代谢物）,得到的原始数据首先经过XCMS软件处理,利用Matlab software 7.0和SIMCA-P11.0等统计软件而建立的多维数据处理和计算方法,进行PCA分析,通过PCA得分图可以更清楚地区分开对照组大鼠与高脂饲料诱导大鼠的代谢物的区别,说明用代谢组学方法可以区分出不同饮食条件下动物的代谢物谱差异。采用OPLS-DA进行进一步的数据处理,由OPLS-DA分析结果可以直观的看出尿液中内源性代谢物含量发生的变化,尿液中代谢物的升高或降低揭示了与此相关的代谢途径发生的变化。4.建立了适合代谢组学研究的LC/MS测定方法。首先通过实验确定了尿液样品的处理方法及测试条件,在14000rpm下高速离心,直接进样分析,色谱条件:色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C8 5μm,4.6mm×150mm;流速:0.8ml/min;柱温:40℃;流动相:乙腈-0.2%HAC水溶液梯度洗脱;UV:254nm;MS:APCI+ESI混合离子化模式,72～1000范围内正离子全扫描模式;气流10.0L/min;温度:350℃;喷雾温度:250℃;毛细管电压:2000V,建立了用于代谢组学研究的LC/MS测定方法,方法学研究表明建立的方法重复性好、灵敏度高,适用于快速的高通量检测。同时采用建立的LC/MS方法分析了不同时间点对照组与高脂饲料诱导大鼠的代谢特征。采用优化的方法,检测到了约100个尿样代谢物,通过提取离子与标准品比对确定了其中的20多个代谢物。得到的原始数据首先经过XCMS软件处理,利用Matlab software 7.0和SIMCA-P11.0等统计软件而建立的多维数据处理和计算方法,进行PCA分析,PCA分析能够揭示出对照组大鼠与高脂饲料诱导肥胖大鼠的总体代谢物的差异;为了找出发生变化的重要的内源性代谢物,我们采用了一种新型的监督性算法OPLS-DA。OPLS-DA回归系数能够直观的表示出尿样中重要代谢物的升高或者降低,从而研究关键代谢物通道的变化。5.对三种建立的色谱分析方法在代谢组学研究中的应用进行了比较。体内代谢产物多而复杂,对某一物种、某个组织或其细胞中所有的代谢途径中的所有代谢产物同时进行全面的高通量的定性和定量分析,在理论上行得通。但目前没有任何一个分析技术能够同时对代谢组中的所有化合物进行分析。只能通过选择性地提取结合各种分析技术的并行分析来解决这个问题,同时考虑仪器和技术的检测速度、选择性和灵敏度,以选择出一种最适合目标化合物的分析方法。不同的分析方法所能测定的代谢物不同,所涵盖的信息也就不同。将不同的方法综合用于某一疾病的代谢组学研究能够优势互补,更好的更全面的解释生物体内发生的变化。pCEC/MS代表着代谢组学分析发展的一个方向,有待于进一步研究。

论文目录

• 简写说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 代谢组学概述
• 1.1.1 代谢组和代谢组学的含义
• 1.1.2 代谢组学与其它组学的区别和联系
• 1.1.3 代谢组学研究的历史沿革
• 1.1.4 代谢组学研究成为功能基因组学研究重要组成部分的必然性
• 1.1.5 代谢组学研究的现状与应用领域
• 1.1.6 代谢组学研究的技术
• 1.1.7 代谢组学研究中存在的问题
• 1.1.8 代谢组学研究的发展趋势
• 1.2 肥胖概述
• 1.2.1 肥胖
• 1.2.2 肥胖与常见慢性病的关系
• 1.3 课题立项背景与意义
• 1.4 本文的主要工作
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 研究的关键问题
• 参考文献
• 第二章 基于GC/MS 的代谢组学研究方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 动物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 尿液样本用量的选择
• 2.3.2 衍生化试剂的选择
• 2.3.3 前处理方法中催化剂的选择
• 2.3.4 衍生条件的优化
• 2.3.5 GC/MS 升温程序的选择
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 尿液样本用量的确定
• 2.4.2 衍生化试剂的选择
• 2.4.3 前处理方法中催化剂的确定
• 2.4.4 衍生化过程中萃取效率与衍生化效率的确定
• 2.4.5 GC/MS 升温程序的确定
• 2.4.6 GC/MS 方法的确定
• 2.4.7 小结
• 2.5 用于代谢组学研究的GC/MS 方法学考察
• 2.5.1 样品制备
• 2.5.2 GC/MS 测定
• 2.5.3 线性和检测范围
• 2.5.4 稳定性实验
• 2.5.5 精密度实验
• 2.5.6 重复性实验
• 2.5.7 加样回收率实验
• 2.5.8 小结
• 2.6 结论
• 参考文献
• 第三章 基于pCEC 的代谢组学研究方法的建立
• 3.1 引言
• 3.1.1 毛细管电色谱的理论研究
• 3.1.2 毛细管电色谱中的新技术
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 实验动物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 尿样的前处理
• 3.3.2 衍生条件的优化
• 3.3.3 检测波长的选择
• 3.3.4 酸溶液的选择
• 3.3.5 酸改性剂浓度的影响
• 3.3.6 流动相组成的影响
• 3.3.7 操作电压的影响
• 3.3.8 梯度洗脱条件的优化
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 尿样的前处理
• 3.4.2 衍生条件的优化
• 3.4.3 检测波长的选择
• 3.4.4 酸溶液的选择
• 3.4.5 酸改性剂浓度的影响
• 3.4.6 流动相组成的影响
• 3.4.7 操作电压的影响
• 3.4.8 梯度洗脱条件的优化
• 3.4.9 pCEC 方法的确定
• 3.5 用于代谢组学研究的pCEC 方法学考察
• 3.5.1 样品的制备
• 3.5.2 pCEC 测定
• 3.5.3 标准品的测定
• 3.5.4 方法学考察
• 3.5.6 稳定性实验
• 3.5.7 精密度实验
• 3.5.8 重复性实验
• 3.5.9 加样回收率实验
• 3.5.10 讨论
• 3.6 结论
• 参考文献
• 第四章 基于LC/MS 的代谢组学研究方法的建立
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 尿样的前处理
• 4.3.2 流动相的选择
• 4.3.3 MS 条件考察
• 4.4 LC/MS 实验条件的确定
• 4.4.1 尿样的前处理
• 4.4.2 色谱柱选择和流动相的确定
• 4.4.3 MS 条件的确定
• 4.5 用于代谢组学的LC/MS 方法的建立
• 4.5.1 色谱条件
• 4.5.2 样品制备
• 4.5.3 方法学考察
• 4.5.4 结果与讨论
• 4.5.5 小结
• 4.6 结论
• 参考文献
• 第五章 建立的色谱分析方法在代谢组学研究中的应用
• 5.1 肥胖大鼠模型的建立
• 5.2 对照组大鼠与肥胖大鼠的体重比较
• 5.3 数据处理方法
• 5.4 尿样溶液的代谢组学分析
• 5.4.1 大鼠尿样GC/MS 测定与数据分析
• 5.4.2 大鼠尿样的pCEC 测定与数据分析
• 5.4.3 肥胖大鼠尿样的LC/MS 测定与结果分析
• 5.5 结论
• 第六章 三种色谱分析方法的比较
• 第七章 研究总结与展望
• 7.1 研究工作总结
• 7.1.1 建立了用于代谢组学研究的GC/MS 测定方法
• 7.1.2 建立了用于代谢组学研究的pCEC 测定方法
• 7.1.3 建立了用于代谢组学研究的LC/MS 测定方法
• 7.2 论文创新点
• 7.3 展望
• 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢