重组人酸性成纤维细胞生长因子—穿膜肽融合蛋白的克隆、表达及纯化研究

论文摘要

酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor, aFGF）是FGF家族的一员,具有广泛的生理药理作用,在组织和器官发育、血管发生、细胞的分化与凋亡、肿瘤发生和伤口愈合等方面发挥重要作用。然而aFGF作为生物大分子进入细胞发挥作用是通过激活其受体实现的,在没有受体存在的情况下,进入细胞发挥作用成了不可忽略的难题。因此将aFGF与穿膜肽（transcriptional activator protein, Tat）融合表达并使其进入细胞发挥作用具有一定的意义。本研究拟利用基因工程技术将aFGF19-154-Tat与表达载体相连接后导入到适当的宿主细胞中,使其高效表达aFGF19-154-Tat融合蛋白,分离纯化获得具有促细胞增殖活性的融合蛋白,为进一步开发基因工程药物奠定基础。目的：以大肠杆菌为宿主菌,利用基因工程技术表达重组人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）-穿膜肽（Tat）融合蛋白,建立aFGF19-154-Tat中试规模的发酵、纯化工艺以及体外生物学活性测定方法,为进一步开发aFGF19-154-Tat融合多肽创新药物奠定基础,并为相关基因工程药物提供实验依据。方法：从人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得aFGF的cDNA,并以aFGF的cDNA为模板,使用含有Tat片段的引物扩增出aFGF19-154-Tat目的基因。将aFGF19-154-Tat片段连接到原核表达载体pET3c中,构建重组原核表达质粒pET3c-aFGF19-154-Tat,表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中,IPTG诱导表达,筛选高效表达的工程菌。工程菌的摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵,通过阳离子交换（CM-Sepharose FF）层析、肝素亲和层析（Heparin-Sepharose CL-6B）和凝胶排阻层析（Sephadex G-50）方法分离纯化目的蛋白aFGF19-154-Tat。Western blotting和高效液相色谱分析纯化的aFGF-Tat融合蛋白,MTT法体外检测aFGF-Tat融合蛋白对NIH 3T3细胞的促增殖作用。结果:DNA测序结果证实成功构建pET3c-aFGF19-154-Tat重组质粒,并在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达aFGF19-154-Tat融合蛋白。优化表达条件：37℃条件下培养,当A600为08时加入终浓度为0.8mmM的IPTG诱导4h,表达量达15%以上。高密度发酵结果显示,每升发酵液可获得菌体90g。菌体超声破碎,经SDS-PAGE证实其相对分子质量与理论预期值相符,并且是可溶性表达,通过阳离子交换层析、肝素亲和层析和凝胶排阻层析纯化,获得aFGF19-154-Tat融合蛋白,高效液相色谱分析显示融合蛋白纯度高于95%。Western blotting分析表明表达产物与人aFGF多克隆抗体具有特异结合能力。MTT法体外检测证实融合蛋白具有促进NIH 3T3细胞增殖作用,这与阳性对照组aFGF的生物学活性基本相同并显著高于空白对照组（P<0.01）。结论：成功构建表达质粒pET3c-aFGF19-154-Tat,并得到重组人aFGF19-154-Tat融合蛋白工程菌,发酵纯化获得aFGF19-154-Tat融合蛋白,体外试验证实了aFGF1g-154-Tat融合蛋白具有促细胞增殖活性,这对日后研究治疗损伤修复类药物提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 研究目的及现状
• 1.2 酸性成纤维细胞生长因子的研究概况
• 1.3 穿膜肽的研究进展
• 1.4 实验设计的技术路线
• 第二章 实验仪器及材料
• 2.1 主要实验仪器与设备
• 2.2 常用试剂
• 2.3 菌株和质粒
• 2.4 实验试剂
• 第三章 实验方法
• 3.1 aFGF-Tat基因克隆
• 3.2 重组质粒pET3c-aFGF-Tat的构建和鉴定
• 3.3 pET3c-aFGF-Tat的诱导表达及可溶性分析
• 3.4 工程菌的发酵及目的蛋白的分离纯化
• 3.5 aFGF-Tat融合蛋白生物学活性的检测
• 第四章 结果
• 19-154-Tat的构建和分析'>4.1 重组质粒pET3c-aFGF_19-154-Tat的构建和分析
• 4.2 工程菌在大肠杆菌中的表达
• 4.3 aFGF-Tat的发酵及分离纯化
• 4.4 aFGF-Tat的活性检测
• 4.5 aFGF-Tat的活性检测条件优化
• 第五章 讨论
• 5.1 穿膜肽应用的意义
• 5.2 表达
• 5.3 融合蛋白的分离纯化
• 5.4 优化活性检测的条件
• 5.5 后续实验简介
• 5.6 展望
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介