蝴蝶兰ACC氧化酶和ACC合成酶基因融合反义表达载体的构建及遗传转化

论文摘要

本研究以蝴蝶兰（Phalaenopsis hybrid）为材料,克隆了蝴蝶兰ACC氧化酶和ACC合成酶的基因片段,构建了二者的融合反义基因的植物表达载体。采用根癌农杆菌介导法,将ACC氧化酶反义基因导入蝴蝶兰,并对蝴蝶兰的转化植株进行了GUS组织化学染色检验和筛选,还对蝴蝶兰的转化植株进行了PCR分子检验。主要研究结果如下:（1）蝴蝶兰ACC合成酶和ACC氧化酶基因的克隆与序列分析根据已发表的蝴蝶兰ACC氧化酶和ACC合成酶基因序列设计引物,从蝴蝶兰总RNA中克隆出ACS保守区的461 bp片段和333 bp的ACO片段,和测序后通过菌落PCR、双酶切、测序鉴定,得到两个基因片段的克隆。（2）完成两个基因的克隆和测序后,将461 bp的ACS基因片段和333 bp的ACO基因片段以反义的方向插入到中间载体pBI221 CaMV 35S启动子的下游,酶切后获得含有CaMV35S启动子的ACS和ACO的反义融合片段。（3）将此包含启动子的反义融合片段连接到植物表达载体pCAMBIA3301中,获得ACC合成酶基因和ACC氧化酶基因融合的反义表达载体,反义表达载体,通过农杆菌和基因枪的方法导入蝴蝶兰原球茎。（4）植株再生体系的建立蝴蝶兰的胚为材料,结果表明蝴蝶兰胚非共生萌发适宜的培养基为:1/3MS+ KT 0.5 mg/L + CW15.0%+AC2.0 g/L+蔗糖20.0 g/L+琼脂8.0 g/L。（5）转化体筛选及植株再生将预培养3-4天的外植体与农杆菌菌液浸染5-15分钟后,共培养2-3天,然后转化到含MLPN和PPT的选择培养基上进行分化筛选,转入外源基因的转化体将会在这一系列筛选过程中发芽、生根,获得转基因植株。（6）转基因植株PCR检测采用GUS组织化学染色法对蝴蝶兰的转化植株进行了检验和筛选,并用PCR对蝴蝶兰的转化植株进行了分子检验,得到了反义融合基因的转化植株。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 蝴蝶兰组培快繁及基因工程研究进展
• 1.1.1 蝴蝶兰的组织培养
• 1.1.2 蝴蝶兰的基因工程研究进展
• 1.2 植物体内乙烯的合成及生物作用
• 1.2.1 乙烯的生物合成
• 1.2.2 乙烯的信号传递
• 1.2.3 乙烯的生理作用
• 1.3 反义RNA技术
• 1.4 利用乙烯合成途径相关基因延长花期的研究
• 1.4.1 抑制乙烯生物合成有关酶基因的表达
• 1.5 蝴蝶兰遗传工程主要转化方法
• 1.5.1 基因枪法
• 1.5.2 根癌农杆菌介导法
• 1.5.3 其它转化方法
• 2 引言
• 3 实验材料和方法
• 3.1 ACC合成酶及ACC氧化酶基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 实验材料
• 3.1.3 菌株、质粒及主要生化试剂
• 3.1.4 实验方法
• 3.1.5 转化大肠杆菌
• 3.1.6 菌液PCR检测
• 3.1.7 菌液扩摇
• 3.1.8 质粒提取及双酶切
• 3.3 融合反义基因中间载体pBI221-RACOACS的构建
• 3.3.1 菌株与质粒
• 3.3.2 主要生化试剂
• 3.3.3 试验方法
• 3.4 融合反义表达载体pCAMBIA3301-RACOACS的构建及鉴定
• 3.4.1 菌株和质粒
• 3.4.2 实验用限制性内切酶和试剂盒
• 3.4.3 菌株培养条件
• 3.4.4 方法
• 3.5 液氮冻融法转化农杆菌及转化子的鉴定
• 3.5.1 农杆菌培养基
• 3.5.2 抗生素的配制
• 3.5.3 转化步骤
• 3.5.4 转化子的PCR鉴定
• 3.5.5 菌种保存
• 3.6 受体材料的准备及侵染
• 3.6.1 受体材料的准备
• 3.6.2 乙酰丁香酮的配制
• 3.6.3 抗生素的配制
• 3.6.4 原球茎的预培养
• 3.6.5 农杆菌培养菌液准备
• 3.6.6 农杆菌的侵染和共培养
• 3.6.7 原球茎的选择培养和植株再生
• 3.6.8 转化植株的鉴定
• 4 结果分析
• 4.1 RNA样品的完整性检测
• 4.2 ACC合成酶及ACC氧化酶基因的克隆与序列分析
• 4.3 中间载体pBI221-RACOACS的构建
• 4.4 植物表达载体的构建
• 4.5 侵染时间对转化的影响
• 4.6 侵染浓度
• 4.7 AS处理对遗传转化的影响
• 4.8 蝴蝶兰转基因植株的PCR鉴定和增殖
• 5 讨论
• 5.1 取材时间
• 5.2 中间载体的构建
• 5.3 融合反义表达载体的构建
• 5.4 PCR检测
• 5.5 农杆菌介导转化蝴蝶兰
• 附图
• 参考文献
• ABSTRACT