论文摘要
慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）是由多种因素造成的胰腺组织进行性的慢性炎症性疾病,最终导致胰腺内、外分泌功能不全。CP患者临床表现为腹痛、脂肪泻、糖尿病胰腺钙化及胰腺假性囊肿等。CP在病理学上主要表现为大量的炎细胞浸润,胰腺组织广泛的纤维化,腺泡萎缩,胰管变形,其中纤维化的形成和大量细胞外基质（extracelluar matrix, ECM）的沉积为主要病理学特征。由于其病因复杂,发病机制不明确,目前尚无针对纤维化有效的治疗方法。第一部分DBTC尾静脉注射CP大鼠模型的构建目的:采用二丁基二氯化锡（dibutyltin dichloride, DBTC）尾静脉单次注射的方法,构建CP大鼠模型,观察CP大鼠病理学改变、胰腺纤维化程度及体内氧化应激水平,为后续开展CP相关机制研究奠定基础。方法:20只雄性Wistar大鼠,体重180-200g,随机分成慢性胰腺炎组（CP组）和对照组（Vehicle control, VC组）。DBTC（8mg/kg）尾静脉单次注射建立CP大鼠模型,对照组尾静脉注射相同体积的溶剂。造模后每隔一周相同时间点监测大鼠体重。4周后,腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）,心脏放血处死大鼠。苏木素-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色后行组织病理学评分来判断胰腺组织损伤程度;以Sirius-Red染色和胰腺组织匀浆羟脯氨酸水平来评估胰腺组织纤维化程度;检测胰腺组织羟脯氨酸评估大鼠胰腺氧化应激水平。结果:造模4周后, CP组大鼠存活率为80%,VC组大鼠存活率为100%。自造模第二周开始,CP组大鼠体重较VC组显著降低。CP组大鼠病理特征符合CP病理改变,表现为胰腺正常结构破坏、腺泡萎缩、纤维化和炎症细胞浸润。VC组无任何病理改变。CP组大鼠胰腺组织丙二醛（Malondialdehyde, MDA）（1.18±0.37nmol/mgprot vs. 0.22±0.27nmol/mgprot, P<0.05）和羟脯氨酸（650.58±52.27μg/mg vs.167.88±11.20μg/mg, P<0.05）水平显著高于正常对照组。结论:DBTC诱导的CP大鼠模型具有良好的可重复性。该大鼠模型具有CP典型的病理改变,适用于CP发病机制和治疗研究。第二部分Fractalkine/CX3CR1在慢性胰腺炎大鼠胰腺中的表达目的:检测VC组和CP组大鼠胰腺中不规则趋化因子（fractalkine, FKN）和CX3CR1表达。方法:16只雄性Wistar大鼠,体重180-200g,随机分成慢性胰腺炎组（CP组）和对照组（VC组）。DBTC（8mg/kg）尾静脉单次注射建立CP大鼠模型,对照组尾静脉注射相同体积的溶剂。4周后,腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）,心脏放血处死大鼠。HE染色后行组织病理学评分来判断胰腺组织损伤程度;以Sirius-Red染色和胰腺组织匀浆羟脯氨酸水平来评估胰腺组织纤维化程度;使用荧光实时定量RT-PCR（real-time RT-PCR）和免疫组化法分别检测胰腺组织中FKN和CX3CR1 mRNA和蛋白水平的表达。结果:CP组胰腺异常结构、腺泡萎缩、纤维化和炎症细胞浸润各项评分均高于VC组。CP组胰腺组织羟脯氨酸（690.19±49.49μg/mg vs.139.75±13.39μg/mg, P<0.05）水平显著高于VC组。CP组FKN和CX3CR1 mRNA表达亦显著高于VC组。免疫组化分析表明,CP组FKN和CX3CR1在炎症细胞、受损的腺泡细胞、胰腺导管细胞和血管内皮细胞上都有不同程度的表达上调。结论:在CP大鼠模型的胰腺组织中,FKN和其受体CX3CR1在mRNA和蛋白水平都显著升高。FKN和其受体CX3CR1通过募集和粘附炎症细胞参与CP胰腺纤维化过程。第三部分α-生育酚和TRF对CP治疗作用对比及机制研究目的:对比α-生育酚（Tocopherol, Toc）和富含生育酚三烯的棕榈油（Tocotrienols-rich Fraction, TRF）对CP大鼠治疗效果,并研究其作用机制。方法:32只雄性Wistar大鼠,随机分成四组,其中三组大鼠造模后分别给予0.6ml大豆油、0.6ml含有α-Toc（800 mg/kg）的大豆油及0.6ml含有TRF（800 mg/kg）的大豆油每日1次,连续灌胃4周。对照组大鼠给予0.6ml大豆油每日1次,连续灌胃4周。4周,腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）,心脏放血处死大鼠。HE染色后行组织病理学评分来判断胰腺组织损伤程度;以Sirius-Red染色和胰腺组织匀浆羟脯氨酸水平来评估胰腺组织纤维化程度;使用免疫组化法检测胰腺α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscular actin,α-SMA）的表达,并对4组大鼠胰腺组织α- SMA阳性细胞进行评分。采用real-time RT-PCR法分别检测胰腺组织中TGF-β1和collagen（col）-α1（I）mRNA的表达。结果:α-Toc和TRF都能降低CP大鼠胰腺MDA水平,改善炎症细胞浸润和纤维化病理评分并下调TGF-β1和col-α1（I）mRNA的表达。在改善炎症细胞浸润和纤维化病理评分并下调TGF-β1 mRNA的表达方面,TRF较α-Toc更为有效。结论:口服α-Toc和TRF都能改善DBTC诱导的CP大鼠胰腺炎症和纤维化程度,TRF较α-Toc更为有效。通过上述研究,本课题得出以下结论:1、DBTC（8mg/kg）尾静脉注射能成功诱导CP大鼠模型;2、CP大鼠胰腺FKN和其受体CX3CR1在mRNA和蛋白水平都显著上调,FKN和其受体CX3CR1通过募集和粘附炎症细胞参与CP胰腺纤维化过程;3、口服α-Toc和TRF都能改善DBTC诱导的CP大鼠胰腺炎症和纤维化评分,TRF效果更优于α-Toc。
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