论文摘要
胃缺血再灌注（gastric ischemia-reperfusion,GI-R）损伤的发生与多种因素有关,如胃粘膜内氧自由基生成过多、内皮素水平升高、胃微循环障碍、白细胞浸润、一氧化氮释放、胃酸分泌增多、前列腺素合成减少等。然而,目前对GI-R的研究多集中于胃粘膜局部致损伤因素及其治疗上,而缺乏整体情况下对其调控机制的研究,尤其是中枢核团对其调控的资料较少。下丘脑室旁核（paraventricular nucleus,PVN）在胃的中枢调节中占有重要位置,对胃酸分泌、胃运动、胃电活动均有广泛的调节作用。PVN内包含有多种神经元,可分泌多种神经递质,其中包括血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）能神经元以及在神经元胞体中高密度的AngⅡ的Ⅰ型受体（AT1-R）。PVN以及AngⅡ能神经元及其受体参与对应激性胃粘膜损伤的调节,中枢AngⅡ增加可增强交感神经兴奋。我们以前的研究也表明,电刺激PVN可通过迷走和交感神经通路减轻GI-R损伤,然而,关于外源性微量AngⅡ注射到PVN后,是否影响GI-R损伤以及其可能的外周神经调控机制,目前尚无报道。因此,需要探讨交感和副交感神经是否参与PVN AngⅡ对GI-R损伤的调节。此外,胃粘膜虽易损伤,但其修复快,胃粘膜组织的损伤和修复是一种经常存在的生理性机制,表明胃粘膜细胞具有较强的凋亡调控机制和增殖修复能力。胃肠粘膜完整性的维持,有赖于上皮细胞凋亡和细胞增殖之间的动态消长平衡。在参与凋亡增殖调控作用的信号通路中,核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路与细胞凋亡的关系密切,参与多种凋亡相关基因的转录调控。并且,缺血-缺氧、氧自由基、肿瘤坏死因子-α,环氧合酶-2等胞外刺激信号,均可激活NF-κB信号通路。NF-κB被激活后,由胞质移位至细胞核,与DNA上靶基因启动子区域上游的调节位点结合,启动其下游与免疫炎症和应激反应等相关基因的转录:如凋亡相关基因Bcl-2/Bax,环氧合酶-2,细胞间粘附分子等的转录程序,使其表达增多,从而进一步引起组织细胞的损伤。与细胞凋亡和增殖有关的基因中,Bcl-2和Bax基因是重要的调节因子。Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例,是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素,Bcl-2和Bax协同调节细胞凋亡,影响胃粘膜损伤过程。然而,目前对GI-R损伤的研究,仍局限于其抗损伤机制方面,而对于其抗凋亡,促增殖修复机制的研究却较少。为了深入研究PVN微量注射AngⅡ对GI-R损伤的作用,本研究在观察PVN内微量注射AngⅡ时间和剂量依赖性影响GI-R损伤的基础上,首先,采用药理学和手术等实验手段,探讨了副交感和交感神经是否参与PVN微量注射AngⅡ对GI-R损伤的神经调节作用;然后,采用免疫组化、免疫印迹、RT-PCR等方法,观察PVN内微量注射AngⅡ对胃粘膜细胞凋亡和增殖修复的影响,以及NF-κB信号通路及其凋亡调控基因Bcl-2、Bax、caspase-3等分子的变化,阐明PVN AngⅡ对GI-R损伤的局部调节作用。第一部分室旁核内微量注射血管紧张素Ⅱ对大鼠胃缺血-再灌注损伤的影响及其外周神经机制最近,我们报道了电刺激下丘脑PVN对GI-R损伤具有明显的保护作用,但PVN内AngⅡ对GI-R损伤是否有调控作用尚不知道。本研究采用夹闭大鼠腹腔动脉30 min,去除动脉夹后分别再灌30 min、1 h、3 h、6 h、24 h的GI-R损伤模型,于单侧PVN内微量注射AngⅡ,应用大体和组织学方法观察胃粘膜损伤情况。结果表明,微量注射AngⅡ（3、30、300 ng）到PVN后,可剂量依赖性抑制GI-R损伤,其中AngⅡ（30 ng）能明显减轻GI-R 1h和3 h的胃粘膜损伤。AngⅡ的这种保护效应可被AngⅡAT1受体拮抗剂洛沙坦（losartan,5μg）侧脑室给药所阻断。此外,静脉内注射β受体阻断剂普萘洛尔及肾上腺交感神经切断能阻断AngⅡ的保护效应,腹腔交感神经节切除及静脉内注射α受体阻断剂酚妥拉明能增强该效应,而膈下迷走神经切断和静脉内注射M受体阻断剂阿托品对此无明显影响。此外,PVN内微量注射AngⅡ可增加缺血后的胃血流量。这些结果提示PVN给予AngⅡ对GI-R损伤具有保护作用,其中枢效应由PVN内的AT1受体所介导;其外周神经调控通路由交感神经-肾上腺-β受体通路所介导,β-受体兴奋后,使胃血流量增加,从而减轻胃粘膜损伤。第二部分胃粘膜细胞NF-κB信号通路参与室旁核内微量注射血管紧张素Ⅱ对大鼠胃缺血-再灌注损伤的保护作用为了进一步研究PVN内微量注射AngⅡ对大鼠GI-R损伤保护作用的局部分子机制,本实验在健康Sprague-Dawley大鼠,PVN微量注射AngⅡ后,制备GI-R模型,采用免疫组化、免疫印迹及RT-PCR等实验技术,观察了PVN微量注射AngⅡ（30 ng）后,GI-R1 h后胃粘膜细胞增殖、凋亡的变化、NF-κB通路的激活及凋亡相关基因Bcl-2和Bax、下游因子COX-2的表达,以及胃粘膜丙二醛（malonaldehyde,MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性的改变,以揭示PVN微量注射AngⅡ对GI-R后胃粘膜细胞增殖和凋亡的变化规律,NF-κB的激活规律,以及NF-κB的活化与胃粘膜细胞凋亡和增殖修复的关系。结果显示:（1）GI-R 30 min、1 h后增殖细胞明显减少,GI-R 3 h后开始增多,GI-R 6 h已完全恢复正常;GI-R 30 min、1 h、3 h后凋亡细胞百分比明显增加,复灌1 h时胃粘膜凋亡细胞达高峰,以后逐渐减少,复灌6 h时基本恢复正常水平;流式细胞仪检测培养的人胃粘膜上皮细胞,在缺氧1 h复氧6 h、24 h、48 h后凋亡率明显增加。（2）PVN微量注射AngⅡ后,明显抑制GI-R 1 h诱导的胃粘膜细胞凋亡,促进胃粘膜细胞增殖。（3）GI-R 1 h后,NF-κB（p65）及磷酸化IκB-α（p-IκB-α）的蛋白表达水平明显增高,PVN内微量注射AngⅡ（30 ng）后,NF-κB（p65）及p-IκB-α蛋白表达水平减少并接近正常。IκB-α蛋白表达水平在GI-R 1 h后降低,而在PVN内微量注射AngⅡ（30ng）后升高,并基本恢复到正常水平。AngⅡ的这些效应可被洛沙坦阻断。给予NF-κB通路抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC,200 mg╱kg）后,对GI-R及AngⅡ组均能减轻胃粘膜损伤及凋亡,促进增殖,抑制NF-κB活性。（4）PVN微量注射AngⅡ,能明显升高GI-R 1 h后抗凋亡因子Bcl-2水平,而不显著影响促凋亡因子Bax的水平,因此Bcl-2/Bax比值增加;同时,使caspase-3蛋白水平下降,COX-2 mRNA表达减少,MDA含量下降,而对SOD活力无明显影响。PDTC预处理可减低胃粘膜MDA含量,对SOD活力无明显影响。这些结果表明,PVN微量注射AngⅡ后对GI-R损伤的保护作用,与抑制胃粘膜细胞凋亡和促进增殖有关。由于PVN微量注射AngⅡ后胃粘膜血流量增加,使GI-R产生的氧自由基减少,COX-2表达减少,从而抑制NF-κB的激活,提高其下游的抗凋亡、促增殖的调控因子Bcl-2的表达,增加Bcl-2/Bax比值,实现其保护作用。总结1.下丘脑PVN内微量注射AngⅡ（3 ng,30 ng,300 ng）能剂量依赖性减轻GI-R损伤,注射AngⅡ30 ng能显著减轻GI-R 1 h、3 h后胃粘膜的损伤,并增加缺血后胃血流量。2.PVN内微量注射AngⅡ后,在中枢通过PVN的AT1受体,在外周通过交感神经-肾上腺-β受体通路,介导对GI-R损伤的保护作用。3.PVN微量注射AngⅡ后,可抑制GI-R诱导的NF-κB激活,从而减少胃粘膜细胞凋亡,增加其增殖。4.PVN微量注射AngⅡ通过扩张胃血管,减少氧自由基,抑制胃粘膜细胞COX-2的表达,抑制NF-κB的激活,抑制凋亡相关因子,提高抗凋亡促增殖的调控因子,从而实现其保护作用。