重组耐热植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

论文摘要

植酸酶能将肌醇六磷酸（植酸）分解成为肌醇和磷酸。在食品和饲料中添加植酸酶可促进营养物质的利用,降低磷排出,对降低环境污染有重要意义。同时在医学研究中发现植酸酶的分解产物在人体内具有非常重要的生理功能,给植酸酶在药物方面的应用带来光明的前景。虽然植酸酶已经实现了工业化生产,但在推广中还存在一些问题,最为突出的是植酸酶的热稳定性问题,而目前的商品植酸酶热稳定性较差,所以急需一种耐热性较高的植酸酶。本试验室从国产烟曲霉中获取了耐热植酸酶phyA成熟肽的基因,并实现了其在黑曲霉菌中的分泌性表达。本课题在重组耐热植酸酶的C端加上连续六个组氨酸（His-tag）,通过抗His抗体和抗植酸酶抗体所做的western检测,进一步证实了烟曲霉植酸酶在黑曲霉菌中实现了分泌性表达。通过改变培养基的成分探索最佳培养基,最终使用1%的可溶性淀粉作为碳源,0.5%的硫酸铵作为无机氮源,添加0.5%的表面活性剂Triton-x-100,在上述优化条件下,最高酶活达212.4IU/ml,比优化前酶活提高了1.66倍。对重组黑曲霉发酵所产粗酶液在pH6.0的条件下依次进行G25 sepharose脱盐和Q sepharose离子交换层析得到初步纯化的植酸酶,经western检测证实是来源于烟曲霉的耐热植酸酶。对重组植酸酶部分酶学性质进行研究发现:该酶在pH4.0-6.8和37-90℃性质稳定,在pH6.2有一个酶活峰值。最适反应温度为62℃,同时在80℃处理20min,酶活保持在78%,90℃和100℃处理10min,酶活分别为未处理组的70%和43.9%,具有较好的热稳定性。Mg2+和K+对植酸酶的酶活有促进作用,Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+对酶活有抑制作用。本课题通过改变重组耐热植酸酶的培养基成分,提高了发酵酶活,通过脱盐、离子交换等步骤粗纯了重组耐热植酸酶,并对其部分酶学性质进行了研究,为重组耐热植酸酶的进一步开发应用提供了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 仪器和材料
• 2.1 仪器及物品
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 试剂及溶液
• 第3章 方法
• 3.1 烟曲霉植酸酶基因的亚克隆
• 3.2 重组质粒pYG1.2-phyA-his转化宿主黑曲霉菌M54
• 3.3 SDS-PAGE
• 3.4 粗酶液的制备
• 3.5 钒-钼酸铵法测定重组植酸酶的活性
• 3.6 发酵产酶曲线的绘制
• 3.7 培养基的优化
• 3.8 重组植酸酶的分离纯化
• 3.9 重组植酸酶酶学特性研究
• 第4章 结果
• 4.1 烟曲霉植酸酶基因的亚克隆
• 4.2 重组植酸酶活性测定
• 4.3 重组植酸酶的分离纯化
• 4.4 重组植酸酶酶学性质研究
• 第5章 分析讨论
• 5.1 植酸酶活性测定
• 5.2 重组植酸酶发酵培养基的研究
• 5.3 植酸酶的分离纯化
• 5.4 重组植酸酶酶学性质
• 第6章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 综述
• 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果