论文摘要
研究背景:肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应,是各种慢性肝病共有的病理基础。近年来研究发现,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）在肝纤维化形成过程中发挥关键作用,是肝纤维化时细胞外基质（ECM）的主要来源细胞。各种致病因素作用下引起肝损伤,通过旁分泌或自分泌释放多种细胞因子,使肝星状细胞激活,激活的HSC合成和分泌ECM增加;在肝纤维化逆转过程中,持续的HSC凋亡发挥重要作用。因此,抑制肝星状细胞激活、诱导其凋亡为肝纤维化的治疗提供了新的方法。我们在进行抗肝纤维化药物筛选时发现熊果酸（Ursolic acid,UA）具有抗肝纤维化作用,本研究通过观察熊果酸对肝星状细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨熊果酸抗肝纤维化可能的作用机制。目的:观察熊果酸对肝星状细胞增殖与凋亡的影响;观察熊果酸对肝星状细胞中Bcl-2,Bax和Caspase3蛋白表达的影响,旨在探讨熊果酸诱导肝星状细胞凋亡的可能作用机制。方法:将不同浓度熊果酸（25μM、50μM、75μM、100μM、125μM和150μM）作用于肝星状细胞（HSC-T6）及肝细胞（L02）,分别在药物作用24h、48h、72h后采用MMT法观察熊果酸对HSC-T6及L02细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测熊果酸对HSC-T6凋亡的影响;光镜观察熊果酸作用后细胞形态学变化;通过免疫细胞化学术检测HSC-T6中Bcl-2,Bax,和Caspase3蛋白的表达。结果:①MTT法检测显示: 25μM、50μM、75μM、100μM、125μM和150μM熊果酸均可以抑制HSC-T6细胞的增殖,且随药物浓度增加及作用时间延长,生长抑制率逐渐升高。②熊果酸浓度为25μM、50μM、75μM时可促进L02细胞增殖,但是,当熊果酸浓度大于100μM时表现出抑制L02细胞增殖。③HE染色显示:熊果酸作用HSC-T6细胞48h后,光镜下可见细胞缩小变圆,核浓缩等。④流式细胞仪检测显示:25μM、50μM、75μM熊果酸作用HSC-T6细胞48h后,细胞凋亡率分别为（10.30±3.85）%, （21.87±4.46）%, （31.33±6.18）%,比对照组（2.93±1.60）%明显升高（P<0.01）。⑤免疫细胞化学结果显示:25μM、50μM、75μM熊果酸作用HSC-T6细胞48小时后,Bax及Caspase3蛋白表达较对照组升高（P<0.05）,且呈剂量依赖性,而Bcl-2蛋白表达与对照组无明显差异（P>0.05）。结论:①熊果酸在体外可以较明显的抑制HSC-T6细胞的增殖、诱导HSC-T6细胞凋亡,作用强度呈剂量-时间依赖;②熊果酸对L02细胞的生长具有双向调节作用,低浓度促进增殖,高浓度（≥100μM）抑制L02细胞增殖;③熊果酸可以上调HSC-T6细胞Bax、Caspase3蛋白表达,但对Bcl-2蛋白无明显影响;④熊果酸诱导HSC-T6细胞凋亡的机理可能是通过上调Bax蛋白,降低Bcl-2/Bax比值,促使线粒体通透性增加,再激活Caspase3蛋白诱发细胞凋亡。