食品中黄曲霉毒素B1金标免疫层析检测方法研究

论文题目: 食品中黄曲霉毒素B1金标免疫层析检测方法研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 食品科学

作者: 孙秀兰

导师: 汤坚

关键词: 黄曲霉毒素,食品,金溶胶,免疫层析,检测方法,机理

文献来源: 江南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 强的化学致癌物质,广泛存在于各种食品和饲料中,严重威胁人类和动物的生命安全。目前的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐,已无法满足现场快速检测的要求。因此,研究和建立一种方便、安全和快速的检测方法意义深远。在此,作者以单克隆抗体和纳米金合成标记技术为基础,根据免疫层析的原理,建立了快速、简易的食品中AFB1的纳米金标免疫层析检测方法,并对其相关机理进行了深入探讨。首先通过碳二亚胺法合成AFB1与BSA偶联物,构建AFBl完全抗原。反应起始摩尔比为AFB1-O:载体蛋白BSA 20:1,采用二甲基甲酰胺DMF和PBS(PH7.4)溶液混合溶剂系统,所得偶联物中AFB1-O与BSA的摩尔比为9.34.:1,AFB1-O的利用率为46.7%。通过荧光光谱研究偶联反应对BSA的构象影响。结果表明,AFB1-O对BSA具有荧光猝灭作用,偶联反应使得BSA疏水性增加。将AFBl完全抗原免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合、亚克隆和扩大培养,成功筛选出2株稳定分泌特异性抗AFBl单克隆抗体的细胞株,分别为3A7和5D3。3A7和5D3产生的单克隆抗体效价分别为20,0000和7,0000,亲和常数分别为3.81×10~7和3.43×10~7L/mol,亚类类型均为IgG2a与AFB2、Gl、G2和M2无明显交叉反应,与AFM1呈现出弱的交叉反应,分别为4.08%和2.33%。以10nm金溶胶为例,正交实验优化单分散性金溶胶合成条件。获得的金颗粒平均粒径为10.7 nm,变异系数14.2%。通过紫外.可见光光谱研究不同粒径纳米金溶胶形成过程,探讨反应动力学特征和反应机理。结果证实,反应的初级阶段形成大的空心球体晶核,然后在球体内部逐渐生成小金原子聚集体,聚集体不断分散,逐步形成一定直径的金胶颗粒。球体晶核生成小颗粒聚集体的时间由还原剂的量决定。动力学分析显示,后期反应近似符合一级反应规律。合成了五种不同粒径的金溶胶(10～70 nm范围),并对其进行了表征,结果表明,金溶胶粒径均一,变异系数均小于15%,平均粒径分别为10.7nm,14.4 nm,25.1 nm,36.9nm,67.4nm。通过研究纳米金溶胶与AFB1单克隆抗体(McAb)作用过程,确定稳定标记上述五种粒径金溶胶McAb的最适浓度分别为0.07,0.051,0.033,0.019,0.012 mg/ml,作用时间为5min,pH为7.4。将金标探针复合物进行透射电镜,红外光谱和免疫反应性鉴定,结果表明,McAb的红外光谱未发生明显改变,McAb的免疫亲和常数由3.81×10~7提高到4.14×10~7,效价由20,0000提高到22,0000,常温贮藏60d时,稳定性由42%提高到53%。通过荧光光谱和圆二色谱研究纳米金与AFBl单抗McAb的相互作用机理。结果表明,纳米金对McAb产生静态猝灭,猝灭的速率常数随着温度升高而降低。产生荧光猝灭的原因是,McAb的色氨酸残基与纳米金颗粒之间发生了FOrster偶极一偶极无辐射能量转移。纳米金溶胶与McAb结合位点数为0.8928,结合常数KA为7.009×10~3。根据反应前后热力学焓变⊿H和熵变⊿S,判断氢键和范德华力为纳米金溶胶与McAb之间的主要作用力。二者反应后McAb所处环境的极性未明显改变。McAb的构象组成发生了变化,a-螺旋含量由原来的52.5%升高至54-2%,β-折叠的含量由21.O%降低至19.8%,转角含量由4.6%升高至7.3%,无规则卷曲20.2%略升高至20.5%。McAb与金纳米粒子作用后整体

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中文摘要

英文摘要

第一章 绪论

1.1 黄曲霉毒素的产生和理化特性

1.1.1 黄曲霉毒素的产生及生物合成途径发现

1.1.2 黄曲霉毒素的种类、结构和理化特性

1.2 黄曲霉毒素B_1与食品安全

1.2.1 AFB_1 的危害和毒性机理

1.2.1.1 AFB_1 对动物的危害

1.2.1.2 AFB_1 对人类健康的危害

1.2.1.3 AFB_1 的毒性机理

1.2.2 AFB_1 在食物链中的分布

1.2.3 食品中AF81 的限量标准

1.3 食品中AFB_1的分析方法

1.3.1 发展概述

1.3.2 AFB_1的生物鉴定法

1.3.3 AFB_1 的仪器分析方法

1.3.3.1 薄层色谱(TLC)

1.3.3.2 高效液相色谱(HPLC)

1.3.3.3 质谱分析法(Mass)

1.3.4 AFB_1 的免疫化学分析法

1.3.4.1 免疫化学分析的理论基础

1.3.4.2 检测AFB_1 的免疫化学分析法

1.3.5 不同分析方法的比较

1.4 纳米金免疫快速检测技术的研究进展

1.4.1 纳米金免疫技术的兴起

1.4.2 纳米金合成与标记技术前沿

1.4.3 纳米金免疫检测技术的原理与优势

1.4.4 纳米金免疫检测技术的应用

1.5 立题的目的意义和主要研究内容

1.5.1 立题的目的和意义

1.5.2 主要研究内容

第二章 黄曲霉毒素B_1完全抗原的构建

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验仪器

2.2.3 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 AFB_1 完全抗原的构建原理

2.3.2 AFB_1 羧基活化物的结构鉴定

2.3.3 AFB_1-O-BSA 偶联物的纯化和结构鉴定

2.3.4 AFB_1-O 与BSA 的偶联比及AF81-O 的利用率

2.3.5 AFB_1-O-BSA 偶联物的荧光光谱分析

2.3.6 AFB_1 多抗血清的免疫反应性

2.4 本章小结

第三章 AFB_1单克隆抗体的制备与鉴定

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验仪器

3.2.3 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 Balb/C 小鼠对AFB_1-O-BSA 的免疫应答

3.3.2 分泌抗AFB_1 抗体的杂交瘤的制作及克隆化

3.3.3 阳性克隆的筛选方法

3.3.4 分泌抗AF81抗体的杂交瘤细胞株的生长特性

3.3.5 抗AFB_1 小鼠腹水单克隆抗体的特性

3.4 本章小结

第四章 纳米金溶胶的合成与表征

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验仪器

4.2.3 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 反应条件的确定

4.3.2 可见光光谱分析

4.3.3 单分散性金溶胶合成的最优条件

4.3.4 金溶胶生成的反应动力学

4.3.5 不同粒径金溶胶的表征

4.3.6 外界条件对金溶胶稳定性的影响

4.4 本章小结

第五章 纳米金溶胶标记AFB_1抗体McAb 探针的制备及其作用机理

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验仪器

5.2.3 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 纳米金溶胶与McAb 的作用过程分析

5.3.2 纳米金溶胶标记AFB_1 抗体McAb 的最适条件确定

5.3.3 金标抗体探针的鉴定

5.3.4 纳米金溶胶与McAb 相互作用的荧光光谱分析

5.3.5 同步荧光法研究金溶胶作用后McAb 的构象变化

5.3.6 圆二色谱研究金溶胶作用后McAb 的构象变化

5.3.7 纳米金溶胶与抗体McAb 相互作用机理与免疫反应性讨论

5.4 本章小结

第六章 AFB_1金标免疫层析检测方法的建立、评价及应用

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 实验仪器

6.2.3 实验方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 GICA 检测体系的构建

6.3.2 GICA 检测带的信号强度

6.3.3 GICA 检测过程中的化学体系

6.3.4 标记探针中金溶胶粒径大小对信号强度的影响

6.3.5 GICA 方法定量或半定量分析的方法学评价

6.3.6 GICA 在食品样品检测中的应用

6.3.7 GICA 检测食品样品中AFB_1的提取方法研究

6.3.8 GICA 测定其它食品及饲料中AFB_1 的误差分析

6.3.9 GICA 不同提取方法的测定结果

6.4 本章小结

总结与展望

主要结论

主要创新点

致谢

攻读博士学位期间发表论文清单

发布时间: 2006-07-20

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