人翼状胬肉HMG-CoA还原酶和LDL-R基因表达

论文摘要

目的:翼状胬肉是眼科较为常见的眼表疾病之一,局部球结膜纤维血管组织呈三角形增生并侵犯角膜的一种疾病,目前认为是内因和外因共同作用的结果。增生的组织肥厚,血管扩张向角膜中央生长,可引起角膜散光而导致视力下降。由于其患病率高及术后复发率高等特点,一直受到许多学者的关注。翼状胬肉的发生发展是多因素协同作用的结果,确切机制至今尚未清楚。其病理改变是纤维组织和新生血管的增生,研究其发生、发展的机理对预防和治疗这一疾病具有重要的临床意义。目前越来越多的证据表明翼状胬肉是肿瘤样组织,这包括研究发现翼状胬肉组织中P53基因表达增高;端粒酶的阳性表达;致癌的人类乳头状瘤病毒（HPVs）和强烈的促进有丝分裂因子,即肝磷脂结合的表皮生长因子（HP-EGF）存在;成纤维细胞呈现可以传代的生长变异特性,即杂合子丢失,微卫星不稳性（MSI）等,上述所有均可在肿瘤组织中有同样的发现,这预示翼状胬肉可能具有肿瘤组织的特性。肿瘤组织的一个显著特征就是肿瘤细胞完全失去了机体正常控制的异常增殖,肿瘤细胞旺盛的分裂增殖能力导致对胆固醇需求量的激增,因为胆固醇是构成细胞膜的重要物质,需要从更多的途径获取胆固醇,导致胆固醇代谢紊乱,往往表现在细胞HMG-CoA-R活性和LDL-R数量的改变。在许多肿瘤中,如白血病、胃癌以及肺癌的癌细胞中已经发现LDL-R,HMG-COA-R和酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶（ACAT）在mRNA水平的增高。另外PDT是治疗新生血管有效的方法,正是基于光致敏剂和LDL结合,然后通过LDL-R完成细胞内吞噬光致敏剂的过程,从而对新生血管内皮细胞产生破坏作用。有前期实验研究表明PDT可用于角膜、虹膜等眼前节的新生血管治疗,取得良好的效果。本实验选择研究与胆固醇代谢相关的两个主要基因,即低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA-R）基因,定量检测在原发性、复发性翼状胬肉和正常结膜中的表达差异,探讨翼状胬肉的肿瘤组织样特性以及PDT治疗该疾病的理论基础。方法:1、选择从2007年2月～2008年2月之间在我院诊治的20例患者,年龄在55～70岁之间（男性12例,女性8例）,原发性和复发性翼状胬肉各10例,均为单眼发病;正常结膜标本采自视网膜脱离术中的10只眼。所有翼状胬肉患者入选标准为侵犯角膜范围至少在4mm,按Tan分类均为T3型（T1型:萎缩型翼状胬肉体部薄而透明,纤维血管轻度增生,透过可以清楚分辨巩膜上的血管。T2型:过渡型透过翼状胬肉难以分辨或者部分窥见巩膜上血管。T3型:肥厚型翼状胬肉体部肉质丰满,纤维血管增殖严重,透过难以窥见巩膜血管）。术前未用过药物治疗,血液常规、血液生化检查各项指标均正常。2、标本中提取的总mRNA,等量的mRNA反转录成cDNA,接着cDNA在特异性HMG-CoA-R及LDL-R引物存在下进行QRT-PCR扩增,定量检测两基因在原发性、复发性翼状胬肉和正常球结膜中的mRNA表达水平。结果:1、制备标本总RNA,琼脂凝胶电泳显示RNA样品完好无降解,能够用于基因表达分析。2、成功地进行了组织中微量HMG-COA-R及LDL-R基因表达的荧光定量RT-PCR检测,定量PCR反应体系稳定,结果可靠。3、原发性和复发性翼状胬肉中的HMG-CoA-R基因表达水平均明显高于正常球结膜,原发性翼状胬肉中表达量是正常球结膜的4.2倍,统计学上差异有显著性（P＜0.05）;复发性翼状胬肉是正常球结膜的3.6倍,统计学上差异有显著性（P＜0.05）;原发性和复发性翼状胬肉两者相比无统计学上意义（P＞0.05）。4、原发性和复发性翼状胬肉中的LDL-R基因表达水平均明显高于正常球结膜,原发性翼状胬肉中表达量是正常球结膜的4.1倍,统计学上差异有显著性（P＜0.05）;复发性翼状胬肉是正常球结膜的2.7倍,统计学上差异有显著性（P＜0.05）;原发性和复发性翼状胬肉两者相比无统计学上意义（P＞0.05）。结论:1、实时荧光定量PCR技术能够精确分析少量组织细胞的基因表达,尤其适用于翼状胬肉这样的微量组织标本的定量检测。2、原发性和复发性翼状胬肉中HMG-CoA-R及LDL-R的mRNA表达明显高于正常球结膜组织,这进一步证实翼状胬肉是具有肿瘤样组织样特性的,即胆固醇代谢改变。另一方面LDL-R的高表达使这种疾病具有可以采用静脉内注射维替泊芬行光动力学疗法的可能性。

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