稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶受体的筛选

论文摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）是重要的植物病原真菌，也是研究丝状真菌的重要模式生物。稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶可能作为稻瘟病菌分泌到细胞外与寄主受体蛋白起作用的激发子之一。稻瘟病菌的MGG07965．5基因编码丝氨酸蛋白酶。提取稻瘟病菌70-15菌株的总RNA，逆转录成cDNA后扩增MGG07965．5基因，构建了pPICH-ser表达载体，并转入毕赤酵母GS115中。利用pPICH载体上带有的6×His标签，表达和纯化丝氨酸蛋白酶。为了研究丝氨酸蛋白酶在植物防卫反应中的作用，构建pBD-GAL4-ser诱饵质粒，将其转入酵母菌株AH109中，判定其是否有自激活发生，并鉴定了重组诱饵蛋白的毒性。结果表明，重组诱饵质粒无自激活发生，并且重组诱饵蛋白无毒性。以转化诱饵质粒的AH109菌株与水稻的cDNA酵母文库进行杂交，筛选与丝氨酸蛋白酶有互作关系的酵母克隆。经过两轮的缺陷型培养基SD／Trp-／Leu-／Ade-的筛选和SD／Trp-／Leu-／Ade-／X-α-gal筛选，得到了32个克隆。提取这些酵母克隆菌株的质粒后转入大肠杆菌DH5α中，重新提取大肠杆菌的质粒，并将其一一进行回复性杂交实验。然后用β-半乳糖苷酶检测阳性克隆内LacZ报告基因的表达同时，以pAD-GAL4载体上的通用引物扩增阳性质粒，并将其送去测序。最终获得了12个阳性克隆菌株并对其进行生物信息学分析。结果表明，12个阳性克隆菌株中有4个捕获到的序列为pAD-GAL4载体序列。将剩下的8个菌株进行分类，与蛋白质代谢有关的有3个，与脂类代谢相关的有1个，与离子通道相关的有1个。另外2个未知功能。研究结果将有助于进一步研究稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶与水稻相应受体的互作机制和生物学功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 激发子及其受体
• 1.1.1 激发子研究
• 1.1.2 激发子受体
• 1.1.3 细胞内激发子信号传递
• 1.1.4 激发子参与病害综合防治的前景与展望
• 1.2.丝氨酸蛋白酶
• 1.2.1 丝氨酸蛋白酶概况
• 1.2.2 丝氨酸蛋白酶结构与功能
• 1.2.3 丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母系统中的表达
• 1.3.酵母双杂交技术
• 1.3.1 酵母双杂交系统的原理
• 1.3.2 酵母双杂交系统构成
• 1.3.3 酵母双杂交系统的优点
• 1.3.4 酵母双杂交系统的缺陷
• 1.3.5 酵母双杂交的改进
• 1.3.6 酵母双杂交技术的发展
• 1.3.7 酵母双杂交在蛋白质相互作用中的应用
• 1.4.本研究的意义
• 2 丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母中的表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基母液及培养基
• 2.1.3 主要生化试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 丝氨酸蛋白酶基因的获得及信息学分析
• 2.2.2 稻瘟病菌总RNA的提取
• 2.2.3 DNaseI处理去除稻瘟病菌基因组DNA
• 2.2.4 RT-PCR
• 2法制备大肠杆菌感受态细胞'>2.2.5 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.6 热击转化法
• 2.2.7 大肠杆菌质粒的提取
• 2.2.8 毕赤酵母电转化
• 2.2.9 酵母基因组的提取
• 2.2.2.10 最佳产酶时间的检测
• 2.2.11 利用His标签纯化丝氨酸蛋白酶
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 丝氨酸蛋白酶基因表达载体的构建
• 2.3.2 稻瘟菌丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析
• 2.3.3 丝氨酸蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达
• 2.3.4 丝氨酸蛋白酶的表达
• 2.4 讨论
• 2.4.1 表达菌株和表达载体
• 2.4.2 表达纯化的丝氨酸白酶
• 3 酵母双杂交方法筛选丝氨酸蛋白酶的受体
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要生化试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 丝氨酸蛋白酶基因的获得
• 3.2.2 酵母表达质粒pBD-GAL4-ser载体的构建
• 3.2.3 AH109感受态细胞的制备
• 3.2.4 pBD-GAL4-ser质粒转入 AH109进行自激活检测
• 3.2.5 重组诱饵质粒毒性检测
• 3.2.6 p-AD-Library与pBD-GAL4-ser共转入酵母细胞
• 3.2.7 利用营养缺陷平板进行第一轮筛选
• 3.2.8 利用X-gal平板进行第二轮筛选
• 3.2.9 酵母质粒的提取
• 3.2.10 转化大肠杆菌,获得猎物质粒
• 3.2.11 PCR扩增p-AD-X中插入的片段X
• 3.2.12 一对一酵母双杂交系统的回复性实验确定阳性克隆
• 3.2.13 DNA序列测定与生物信息学初步分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 丝氨酸蛋白酶基因的获得
• 3.3.2 酵母表达质粒pBD-GAL4-ser载体的构建
• 3.3.3 AH109酵母菌株表型验证
• 3.3.4 酵母表达质粒pBD-GAL4-ser载体转入AH109菌株及其阳性克隆的验证
• 3.3.5 酵母表达质粒pBD-GAL4-ser的自激活检测和毒性检测
• 3.3.6 p-AD-Library与pBD-GAL4-ser共转入酵母细胞
• 3.3.7 阳性克隆的分析与鉴定
• 3.3.8 一对一酵母双杂交系统的回复性实验确定阳性克隆
• 3.3.9 DNA序列测定与生物信息学初步分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 酵母双杂交获得的蛋白互作需要多种方法验证
• 3.4.2 丝氨酸蛋白酶受体的筛选
• 3.4.3 阳性克隆菌株的序列分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢