论文题目: 转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育
论文类型: 博士论文
论文专业: 临床兽医学
作者: 郑月茂
导师: 张涌
关键词: 山羊乳球蛋白基因调控序列,绿色荧光蛋白,转基因山羊乳腺上皮细胞,转基因克隆胚
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究通过PCR 法克隆了2 248 bp 的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列,以之作为启动子指导人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中特异性表达,以验证表达载体构建的合理性和外源基因的表达效率。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA 的重组质粒pBLIG,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418 及PCR 筛选获得阳性细胞,以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。应用PCR 法检测转基因克隆胚中的外源基因,并与荧光观察进行对照,从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测,为进一步对荧光阳性胚胎进行移植,以期得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下: 1. 山羊乳腺上皮细胞传至第15 代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体;大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞。第15 代细胞表面微绒毛极为发达,细胞质中线粒体和粗面内质网丰富并含有大量脂滴,表明细胞增殖活力旺盛。染色体分析表明,山羊乳腺上皮细胞系稳定,在离体培养条件下细胞未发生转化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对山羊乳腺上皮细胞培养上清液中的蛋白质进行分离,发现山羊乳腺上皮细胞上清液有3 个条带与标准酪蛋白的3 个条带一致,表明本研究培养的上皮细胞为山羊乳腺上皮细胞,在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。2. 利用PCR 法克隆了山羊β-乳球蛋白基因5′调控序列(2 248 bp),其中包括第一外显子及第一内含子。PCR 产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector 的T 位点。质粒标记为pBLG。序列分析表明,该序列与发表的山羊序列同源性达99.70 %。计算机分析表明,此调控序列含有多个调节因子结合位点或反应元件,包括STAT5(MGF)信号转导子和转录激活子5(乳腺因子)结合位点、CCAAT/增强子结合蛋白结合位点、SP1 因子结合位点、Milk box“乳盒”、TBF 因子结合位点、视黄酸反应元件(RARE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,这提示此调控序列可调控外源基因在乳腺上皮细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体。3. 将质粒pBLG 和表达载体pEGFP-c1 用AseI 和NheI 双酶切,回收目的片断,T4DNA
论文目录:
摘要
Abstract
文献综述
第一章 动物乳腺细胞培养研究进展
1.1 动物细胞培养研究进展
1.1.1 动物细胞培养发展简史
1.1.2 细胞系的生长特点
1.1.3 细胞系(株)的建立与鉴定
1.2 乳腺细胞培养研究进展
1.2.1 乳腺细胞培养方法研究进展
1.2.2 乳腺上皮细胞的类型及相互关系
1.2.3 建立乳腺细胞系的研究
1.2.4 牛乳腺上皮细胞系研究进展
1.2.5 山羊乳腺上皮细胞培养研究进展
第二章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展
2.1 转基因动物的研究
2.1.1 啮齿动物转基因生物反应器模型
2.1.2 反刍动物转基因生物反应器
2.1.3 转基因动物制药的优点
2.2 乳腺系统基因表达调控的分子机制
2.3 转基因动物乳腺生物反应器的原理
2.4 转基因动物乳腺生物反应器的建立
2.4.1 构建表达载体
2.4.2 构建转基因动物
2.4.3 影响外源基因表达效率的因素
2.4.4 提高外源基因表达效率的策略
2.5 基因转移技术
2.5.1 显微注射法
2.5.2 配子介导法
2.5.3 转座子法
2.5.4 逆转录病毒浸染技术
2.5.5 胚胎干细胞转导法
2.5.6 PGCs 技术
2.5.7 核移植介导法
2.5.8 其它新技术的思考
2.6 体细胞基因打靶(同源重组技术)制备动物乳腺生物反应器
2.6.1 体细胞基因打靶的技术优势
2.6.2 体细胞基因打靶的策略
2.6.3 提高体细胞基因打靶的效率
2.7 转基因动物乳腺生物反应器的鉴定
2.7.1 DNA 水平的检测
2.7.2 RNA 水平的检测
2.7.3 目的蛋白的检测
2.7.4 目的蛋白生物活性的检测
2.8 转基因动物乳腺生物反应器的产业化动态
2.9 转基因生物反应器存在的问题、发展前景及我国研究现状
2.10 人乳铁蛋白基因表达载体构建及细胞表达的研究
第三章 哺乳动物细胞转染 DNA
3.1 磷酸钙和 DEAE-葡聚糖介导的转染
3.2 电穿孔和电融合
3.3 利用阳离子型脂质体将 DNA 导入哺乳动物细胞
实验研究
前言
第四章 山羊乳腺上皮细胞体外培养及形态研究
4.1 材料和方法
4.1.1 材料
4.1.2 方法
4.2 结果
4.2.1 乳腺上皮细胞的生长特性
4.2.2 乳腺上皮细胞的类型
4.2.3 山羊乳腺上皮细胞的超微结构
4.3 讨论
4.3.1 乳腺上皮细胞的生长特性
4.3.2 乳腺上皮细胞的类型
4.3.3 山羊乳腺上皮细胞的超微结构
4.4 结论
图版
第五章 山羊乳腺上皮细胞的鉴定
5.1 材料
5.2 方法
5.2.1 山羊乳腺上皮细胞染色体分析
5.2.2 山羊乳腺上皮细胞表达酪蛋白的检测
5.3 结果
5.3.1 山羊乳腺上皮细胞染色体分析结果
5.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
5.4 讨论
5.5 结论
第六章 山羊β-乳球蛋白基因5′调控成分克隆及序列分析
6.1 材料和方法
6.1.1 材料
6.1.2 方法
6.1.2.1 引物设计
6.1.2.2 山羊基因组 DNA 的提取
6.1.2.3 山羊 BLG(β-lactoglobulin)基因5′调控区PCR 扩增
6.1.2.4 琼脂糖电泳
6.1.2.5 目的片段的克隆、鉴定和序列测定
6.2 结果与分析
6.2.1 山羊基因组 DNA 的完整性
6.2.2 山羊 BLG 基因5′调控区的PCR 扩增
6.2.3 重组质粒酶切鉴定结果
6.2.4 序列分析结果
6.3 讨论
第七章 人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体构建
7.1 材料和方法
7.1.1 材料
7.1.1.1 质粒、菌种和细胞
7.1.1.2 主要试剂和仪器
7.1.2 方法
7.1.2.1 人乳铁蛋白cDNA 的改造
7.1.2.2 人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建
7.2 结果
7.2.1 EGFP 和IRES 的PCR扩增后电泳鉴定
7.2.2 IRES 和 EGFP 的亚克隆和酶切鉴定结果
7.2.3 乳腺特异性表达载体构建结果
7.3 讨论
第八章 人乳铁蛋白基因表达载体导入山羊乳腺上皮细胞的研究
8.1 材料
8.1.1 细胞
8.1.2 质粒
8.1.3 试剂
8.2 方法
8.2.1 G418 对山羊乳腺上皮细胞最小致死量测定
8.2.2 电穿孔转化法将人乳铁蛋白基因表达载体导入山羊乳腺上皮细胞
8.2.3 脂质体转染法将人乳铁蛋白基因表达载体导入山羊乳腺上皮细胞
8.2.4 转染细胞的筛选
8.2.5 转染细胞的检测
8.2.5.1 荧光显微镜观察
8.2.5.2 PCR 检测
8.2.6 阳性细胞的体外传代培养
8.3 结果
8.3.1 G418 对山羊乳腺上皮细胞最小致死量的测定结果
8.3.2 G418 抗性山羊乳腺上皮细胞的阳性克隆筛选
8.3.3 转染细胞的检测结果
8.3.3.1 荧光显微镜观察结果
8.3.3.2 PCR 检测结果
8.3.4 阳性细胞的体外传代培养
8.4 讨论
8.5 结论
第九章 转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞诱导产物的检测
9.1 材料和方法
9.1.1 材料
9.1.2 方法
9.1.2.1 细胞诱导表达及样品处理
9.1.2.2 诱导产物的检测
9.2 结果
9.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
9.2.2 Western blot 结果
9.3 讨论
9.4 结论
第十章 转人乳铁蛋白基因山羊克隆胚的发育
10.1 材料和方法
10.1.1 试剂和仪器
10.1.1.1 基础培养液及主要试剂
10.1.1.2 仪器设备
10.1.2 卵母细胞的体外成熟和去核
10.1.2.1 卵丘卵母细胞复合体(COCs)的回收
10.1.2.2 COCs的体外成熟
10.1.2.3 成熟卵母细胞的去核
10.1.3 供体细胞的准备
10.1.4 核移植、电融合及克隆胚的激活
10.1.5 克隆胚的体外培养
10.1.6 胚胎细胞计数
10.1.7 克隆胚外源基因的检测
10.1.7.1 荧光显微镜观察
10.1.7.2 PCR检测
10.1.8 数据分析
10.2 结果
10.2.1 不同构建方法对克隆胚的构建效率
10.2.2 转基因细胞的冻-融对克隆胚发育的影响
10.2.3 克隆胚在SOFaa培养液中的发育
10.2.4 克隆胚在CR1aa培养液中的发育
10.2.5 克隆胚在mCR1aa培养液中的发育
10.2.6 克隆胚在不同培养液中的发育
10.2.7 转基因细胞与正常细胞克隆胚发育的比较
10.2.8 转基因细胞的传代次数对构建克隆胚的影响
10.2.9 EGFP 在克隆胚中的表达
10.2.10 克隆胚外源基因的PCR 检测结果
10.3 讨论
10.4 结论
全文结论
参考文献
致谢
个人简介
发布时间: 2005-12-22
参考文献
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