论文摘要
趋化因子受体CCR7为七次跨膜的G蛋白耦联受体,是CC类趋化因子受体的成员之一,在淋巴细胞及树突状细胞的归巢中起重要作用,并且与多种人类肿瘤的淋巴结转移相关。最近的研究发现CCR7还是预测T1期乳腺癌淋巴结转移有效的分子标志物,基于在淋巴管内皮细胞表达其配体CCL21,所以推测CCR7与其配体的相互作用可能在乳腺癌淋巴管浸润中起重要作用,结合近年来对肿瘤干细胞的研究基础,分析乳腺癌早期淋巴道的转移还可能与肿瘤干细胞的迁移有关。本研究的主要目的是探讨CCR7在乳腺癌淋巴管浸润中的作用及其可能机制,主要从以下三个方面进行:（1）采用免疫组化方法标记102例乳腺癌及20例正常组织中微淋巴管,分析乳腺癌微淋巴管的特点及与淋巴管浸润的关系。并进一步研究CCR7在乳腺癌组织中的表达与淋巴管浸润及临床病理参数之间的关系;（2）观察人乳腺癌MCF-7细胞系的生长形态及分子标志物表达的差异,参照Ponti等的方法并进行适当改良,采用单细胞克隆加干细胞培养基筛选获得乳腺癌干细胞,探讨CCR7在乳腺癌干细胞中的表达及其功能活性;（3）通过RNAi技术下调CCR7基因及蛋白的表达,研究对乳腺癌MCF-7细胞中肿瘤干细胞的增殖及体外迁移的影响。主要结果及结论如下:1.乳腺癌组织中淋巴管与正常乳腺组织内的淋巴管相比具有明显的异质性。表现为:①数目的差异:乳腺癌组织中淋巴管数目多,MLD均值为8.31±5.09,较正常乳腺组织内淋巴管（4.78±1.90）明显增高（P<0.01）;②形态的差异:乳腺癌组织内的淋巴管管腔大且不规则,多呈扩张状,存在淋巴管管壁的开放,并可观察到癌细胞团从开放的淋巴管处进入淋巴管内的现象,也有的淋巴管受压呈裂隙样改变。乳腺癌组织中MLD与患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤的病理类型、雌孕激素受体的表达及淋巴结的转移无关。而淋巴管浸润（Lymphatic vessel invasion, LVI）与乳腺癌淋巴结的转移显著相关（P<0.01）。说明LVI可能是乳腺癌淋巴结转移有效的预测指标。2. CCR7主要表达于乳腺癌细胞的胞质与胞膜,少数可见胞核着色,在乳腺癌中阳性表达率为60.8%。CCR7的表达与病人的年龄,肿瘤大小、雌孕激素受体的表达、病理类型无关,而与乳腺癌淋巴管的浸润及淋巴结的转移相关（ P <0.01 ）,提示CCR7可能在介导癌细胞的淋巴管浸润中起重要作用;3.通过CD44/CD24双标免疫荧光染色可见在常规培养的MCF-7细胞中确实存在不同的肿瘤细胞亚群,主要为CD44+CD24+、CD44+CD24-及CD44-CD24+细胞等,其中CD44+CD24-/Low细胞的比例为12.1%,进一步采用单细胞克隆培养也证实MCF-7细胞也存在生长形态学的差异,有周边规则细胞间连接紧密类圆形的全克隆（holoclone）,有的克隆呈分散生长,形状不规则（亚克隆,paraclone）,及其形状处于两者之间的部分克隆（又称间生态克隆,meraclone）等,且发现在全克隆中富含CD44+CD24-/Low细胞,并通过克隆柱法获得来自全克隆的MCF-7细胞的亚系（MCF-7H）;4.将MCF-7H细胞低密度接种加干细胞培养基悬浮培养筛选扩增可得到呈球样生长的乳腺癌干细胞（MCF-7 stem cells, MCF-7S cells）。细胞球球体规则,折光性好,周边可见明显生长晕。在形成的细胞球中富含CD44+ CD24-/Low细胞,并且MCF-7S细胞在诱导分化时可见明显类管腔样结构形成,表达腺上皮细胞标记物CK18及肌上皮细胞标记物CK14;5.免疫荧光染色发现CCR7也在乳腺癌干细胞球中表达,CCR7表达主要位于细胞的胞质与胞膜。在其配体CCL21刺激后可引起乳腺癌干细胞内钙流增加及肌动蛋白微丝的聚合,说明CCR7在乳腺癌干细胞中表达具有功能活性;6.通过RNA干扰技术可下调乳腺癌干细胞中CCR7基因及蛋白的表达。CCR7表达的下调并不影响MCF-7S细胞的增殖活性,但可抑制其配体CCL21诱导的细胞的趋化迁移运动,提示CCR7与其配体的相互作用可能在介导乳腺癌干细胞的淋巴管浸润及进一步淋巴结的转移中起重要作用。
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