Rap1 shRNA的构建、体内转染效率鉴定以及对肝脏再生影响实验研究

论文摘要

目的:（1）应用RNA干扰技术合成选择沉默rap1基因表达的三种载体。（2）观察rap1 shRNA1、rap1 shRNA2、rap1 shRNA3对小鼠肝脏细胞中Rap1基因表达和蛋白表达的干扰作用。（3）探讨rap1 shRNA对肝脏细胞再生的影响作用。方法:（1）扫描Rap1 mRNA的全序列,记录三个AA及下游19个核苷酸作为潜在作用靶点。GC含量控制在30%～65%之间。由BLAST分析排除与其他基因有高度同源性的序列。由体外转录合成法合成三种Rap1 siRNA序列:Rap1 siRNA1,Rap1 siRNA2,Rap1 siRNA3和阴性对照质粒。并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-3上。酶切后,进行测序检测。（2）昆明小鼠40只,体重18～20g,随机分成4组:Ⅰ组（转染HK组）、Ⅱ组（转染Rap1 shRNA1组）、Ⅲ组（转染Rap1 shRNA2组）、Ⅳ组（转染Rap1 shRNA3组）。于0、16、24h腹腔内注射Rap1 shRNA 2.0～2.5mg/kg（用PBS稀释至1 ml）;48小时后收集小鼠肝脏,用显微荧光、定量RT-PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平。（3）昆明小鼠20只,体重18～20g,随机分成2组:肝大部分切除组（A组,n=10）、肝大部分切除+Rap1 shRNA组（B组,n=10）。A组、B组建立小鼠肝脏大部分切除肝脏再生动物模型,B组在关腹即刻、16、24 h腹腔内注射Rap1 shRNA 2.0～2.5mg/kg（用PBS稀释至1 ml）;A组给予等量PBS;B组、A组,开腹取肝组织,免疫组化法测定肝脏组织中Rap1、ERK、cycline D1和Ki67蛋白表达情况,以及RT-PCR测定肝脏组织中Rap1 mRNA的表达。结果:（1）双酶切证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。（2）Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于50%,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的Rap1 mRNA表达、Rap1蛋白表达均降低。其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳;与转染HK组的细胞Rap1基因、蛋白表达比较有显著差异。（3）B组肝脏组织细胞Rap1基因表达水平明显高于A组,B组肝组织中Ki67蛋白表达水平,ERK蛋白表达水平,cycline D1蛋白表达水平,Rap1蛋白表达水平明显高于A组。结论:（1）利用生物信息技术成功地设计、合成了三种Rap1 shRNA真核表达载体。（2）三种Rap1 shRNA体内转染成功;三种Rap1 shRNA都能降低小鼠肝脏细胞Rap1mRNA和蛋白表达,其中Rap1 shRNA1具有最佳干扰效果:为肝脏再生进一步实验研究奠定了基础。（3）Rap1 shRNA能够有效地抑制Rap1 mRNA的表达,促进肝脏再生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 第一章 Rap1 shRNA的设计、合成及测序鉴定
• 前言
• 1、实验材料
• 2、实验方法
• 2.1 寡核苷酸退火
• 2.2 质粒Pgenesil-3线性化的提取
• 2.3 目标片段克隆到Pgenesil-3质粒表达载体
• 2.4 将真核表达载体转化至感受态细胞DH5α
• 2.5 扩增受转染的感受态细胞DH5
• 2.6 质粒酶切鉴定
• 3、实验结果
• 4、讨论
• 5、结论
• 第二章 Rap1 shRNA体内转染鉴定及对肝细胞
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 4、结论
• 第三章 小鼠肝脏再生动物模型的建立
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 4、结论
• 第四章 Rap1 shRNA对肝脏细胞再生的影响
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 4、结论
• 综述一
• 综述二
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文题录