转ATP/ADP转运蛋白基因水稻的获得及其初步研究

论文摘要

稻米产量的提高和品质改良是当前农业科学研究领域的一个热点,而影响这两个方面的主要因素之一就是淀粉含量和组成。随着分子生物技术的发展,淀粉研究已经进入分子水平,通过对相关基因表达和蛋白互作等情况的不断深入分析,淀粉合成途径及其调控机制正逐步变得明朗。 ADP-葡萄糖（ADPG）的形成是淀粉合成的限速步骤,该反应平衡受底物ATP供给水平调控,最终影响植物淀粉性状。ATP/ADP转运蛋白（AATP）是高等植物质体内膜上负责质体腔和细胞质之间ATP/ADP浓度平衡的一个转运子。已有研究表明它能够影响马铃薯的形态、产量和淀粉组成。为了解AATP是否并且多大程度上影响水稻的产量和稻米品质,及其在水稻淀粉合成中的具体调节功能,本研究采用基因工程方法获得了aatp基因的正反义水稻克隆,在此基础上进行后代遗传分析,稻米产量和淀粉组成评价,并对AATP的表达及其影响进行了初步的探讨。 研究中采用农杆菌介导法对明恢86水稻幼胚诱导的愈伤组织进行转化,获得了水稻aatp基因的正反义转基因水稻和菊芋aatp基因的正反义转基因水稻共117个克隆。通过PCR、Southern blot及后代遗传分析,证明外源基因多以较低拷贝数整合进水稻基因组中。RT-PCR检测分析表明了插入基因在水稻中的高水平表达,且与内源订aatp基因在转录水平上的相互干扰,反义株系的表达水平比正义株系的低。T1代转基因水稻纯合株系的产量考种数据显示,不同转基因株系间波动较大,多数反义水稻株系产量比对照略有下降,个别株系结实率降幅达55%。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 文中所用特殊标识符列表
• 1 文献综述
• 1.1 水稻转基因技术的发展
• 1.1.1 以原生质体为受体的转化
• 1.1.1.1 PEG法
• 1.1.1.2 电击法
• 1.1.1.3 其它转化方法
• 1.1.2 基因枪转化法
• 1.1.3 根癌农杆菌介导转化法
• 1.2 水稻源库流途径研究
• 1.2.1 源库流的概念及其地位关系
• 1.2.2 源库流关系的分子生物学研究
• 1.3 淀粉合成途径的分子生物学研究
• 1.3.1 主要合成途径
• 1.4 ATP／ADP转位蛋白
• 1.4.1 AATP的发现、分布部位及主要功能概述
• 1.4.2 AATP的基因序列、结构功能和生化特性研究
• 1.5 淀粉合成调控及ATP浓度的影响
• 1.5.1 AGPase活性调控及ATP浓度对其影响
• 1.5.2 AGPase在禾本科植物贮存器官中的存在部位
• 1.6 本论文研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试水稻品种
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂和仪器
• 2.1.3.1 主要试剂
• 2.1.3.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 农杆菌菌株的鉴定
• 2.2.2 农杆菌介导法转化水稻
• 2.2.2.1 培养基
• 2.2.2.2 胚性愈伤组织的诱导及继代
• 2.2.2.3 愈伤组织的预培养
• 2.2.2.4 农杆菌的培养及处理
• 2.2.2.5 共培养
• 2.2.2.6 洗除农杆菌
• 2.2.2.7 愈伤组织的筛选
• 2.2.2.8 抗性愈伤组织的继代与植株的再生
• 2.2.2.9 转化率和分化率计算
• 2.2.3 转基因水稻的种植管理
• 2.2.4 转基因水稻的PCR检测
• 2.2.4.1 水稻叶片DNA模板的制备
• 2.2.4.2 PCR扩增引物序列
• 2.2.4.3 PCR检测
• 2.2.5 转基因水稻的Southern blot检测
• 2.2.5.1 水稻叶片DNA的大量提取（CTAB法）
• 2.2.5.2 酶切与电泳
• 2.2.5.3 印迹（向下毛细管法）
• 2.2.5.4 杂交与检测
• 1）的遗传分析'>2.2.6 转基因水稻自交后代（T₁）的遗传分析
• 2.2.7 插入基因在RNA水平上的表达情况及影响检测
• 2.2.7.1 水稻叶片总RNA的提取
• 2.2.7.2 转基因植株的RT-PCR
• 2.2.8 转基因水稻后代产量和品质分析
• 2.2.8.1 转基因株系的经济产量考种
• 2.2.8.2 稻米直链淀粉含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 转aatp基因水稻植株的获得
• 3.2 转基因水稻的分子整合鉴定
• 3.2.1 转化水稻植株的PCR检测
• 3.2.2 转化植株的hpt基因Southern blot检测
• 3.3 转基因水稻的初步遗传分析
• 3.4 转基因水稻内外源基因在RNA水平的表达
• 3.4.1 外源基因ht-aatp的RNA表达
• 3.4.2 内源基因aatp的RNA表达
• 3.5 转基因水稻产量和品质性状的表现
• 4 讨论
• 4.1 外源基因转化及遗传稳定性分析
• 4.2 目的基因在转基因水稻中的表达分析
• 4.3 转aatp基因对淀粉产量和品质的可能影响分析
• 4.4 后续工作及展望
• 参考文献
• 附录
• 图版1：农杆菌介导水稻胚性愈伤组织转化获得再生植株
• 图版2：转基因水稻的潮霉素抗性测定实验
• 基本培养基配方
• 0代（自交）种子遗传分离分析结果'>部分转化植株T₀代（自交）种子遗传分离分析结果
• 致谢