诺卡氏菌腈水合酶和蜡状芽孢杆菌酰胺酶的分离纯化和酶学特性研究

论文摘要

腈类化合物是自然界中广泛分布的一类物质,存在于植物、真菌、细菌、海藻、海绵和昆虫等生物体内。在腈转化酶系三种酶的作用下,腈化合物可以通过两种途径转化为羧酸类化合物。由于在腈转化过程中生成的酰胺类物质和羧酸类物质在化工和制药行业具有广阔的应用前景,腈转化酶的生物转化和生物催化过程越来越受到重视。本文综述了腈转化酶系中腈水合酶和酰胺酶的分离纯化技术以及酶学性质的研究进展,研究了诺卡氏菌（Nocardia sp.）108产生的腈水合酶（NHase）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ZJB-07112产生的酰胺酶（amidase）的纯化方法与性质。通过超声波破碎、硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水作用层析等步骤,得到了电泳纯的凝胶电泳均—的诺卡氏菌腈水合酶。该酶的纯化倍数为10.8倍,酶活回收率为24.3%。该酶由两个亚基构成,一个为α亚基,分子量为27.0 kDa;一个为β亚基,分子量为32.1 kDa。N端氨基酸序列测定结果表明,该酶α亚基的N端氨基酸序列为SEHVNKYTEY,β亚基的N端氨基酸序列为MDGI。对纯化的腈水合酶的酶学特性研究结果表明,其最适反应pH为7.5,最适反应温度为32℃。该酶表现出的热稳定性并不理想,在40℃时其半衰期为1.29h。考察了金属离子对腈水合酶酶活的影响。Ca2+和Co2+能提高该酶的活性,而Zn2+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+、Al3+和EDTA等能抑制该酶活性。以丙烯腈为底物的酶动力学常数Km和Vmax分别为172.42mmol/L和344.83μmol/（min·ml）。通过超声波破碎、离子交换层析和疏水作用层析等步骤,得到了电泳纯的凝胶电泳均一的蜡状芽孢杆菌酰胺酶。酰胺酶的纯化倍数为33.3倍,酶活回收率为21.8%,分子量为60.6kDa。纯化后的酰胺酶成熟蛋白N端氨基酸序列为ATIRPDDKAI。在酰胺酶纯酶的性质研究中,我们发现其最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃。当环境温度从20℃提高到40℃时,该酶的半衰期从7.33h降低到2.15h。在体系中加入了EDTA后,该酶的活性无变化,表明该酶不属于金属酶。Hg+、Ag+和尿素对该酶活性会产生明显的抑制作用,而同样是重金属离子的Cu2+却只对该酶活性有轻微的抑制作用。该酶以丙烯酰胺为底物的酶动力学参数Km和Vmax分别为2.64mmol/L和0.60μmol/（min·ml）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 腈水合酶
• 1.2.1 腈水合酶的种类及来源
• 1.2.2 腈水合酶的反应机理
• 1.2.3 腈水合酶的立体选择性
• 1.2.4 影响腈水合酶活性的主要因素
• 1.2.5 腈水合酶在化工产业中的应用
• 1.2.6 腈水合酶的分离纯化的研究现状
• 1.3 酰胺酶
• 1.3.1 酰胺酶的分类及来源
• 1.3.2 酰胺酶的反应机理
• 1.3.3 酰胺酶的立体选择性
• 1.3.4 影响酰胺酶活性的主要因素
• 1.3.5 酰胺酶在化学中间合成工业中的应用
• 1.3.6 酰胺酶的分离纯化的研究现状
• 1.4 本课题研究背景、内容及意义
• 1.4.1 研究背景
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 研究意义
• 参考文献
• 第二章 诺卡氏菌腈水合酶的分离纯化研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要实验仪器
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 菌种及培养方法
• 2.1.4 蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝法）
• 2.1.5 腈水合酶的活力测定方法
• 2.1.6 腈水合酶粗酶液的提取条件优化
• 2.1.7 硫酸铵分级盐析过程的优化
• 2.1.8 强碱性阴离子交换层析过程的优化
• 2.1.9 疏水相互作用层析
• 2.1.10 电泳
• 2.1.11 电泳转 PVDF膜（湿转）
• 2.1.12 N端氨基酸序列测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 蛋白质标准曲线
• 2.2.2 菌体破碎条件的优化
• 2.2.3 硫酸铵分级盐析过程的优化
• 2.2.4 阴离子交换层析洗脱条件研究
• 2.2.5 疏水相互作用层析
• 2.2.6 腈水合酶的分离纯化检测结果及分析
• 2.2.7 SDS凝胶电泳
• 2.2.8 N端氨基酸序列测定
• 2.3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 诺卡氏菌腈水合酶的酶学特性研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要实验仪器和实验试剂
• 3.1.2 菌种培养方法和酶活分析方法
• 3.1.3 蛋白质浓度测定
• 3.1.4 腈水合酶的酶学特性考察
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 pH对腈水合酶酶活的影响
• 3.2.2 不同pH下腈水合酶的稳定性研究
• 3.2.3 腈水合酶的最适反应温度研究
• 3.2.4 腈水合酶酶的热稳定性（半衰期）研究
• 3.2.5 各种金属离子与化学试剂对腈水合酶的影响
• 3.2.6 底物浓度对腈水合酶活性的影响
• 3.2.7 底物特异性研究
• 3.2.8 腈水合酶的动力学常数的测定
• 3.3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 蜡状芽孢杆菌酰胺酶的分离纯化研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要实验仪器
• 4.1.2 主要实验试剂
• 4.1.3 菌种及培养方法
• 4.1.4 蛋白质浓度测定
• 4.1.5 酰胺酶的活力
• 4.1.6 酰胺酶粗酶液的提取条件优化
• 4.1.7 强碱性阴离子交换层析过程的优化
• 4.1.8 疏水相互作用层析
• 4.1.9 电泳
• 4.1.10 电泳转 PVDF膜（湿转）
• 4.1.11 N端氨基酸序列测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 菌体破碎条件的优化
• 4.2.2 阴离子交换层析洗脱条件研究
• 4.2.3 疏水相互作用层析
• 4.2.4 酰胺酶分离纯化检测结果及分析
• 4.2.5 SDS凝胶电泳
• 4.2.6 N端氨基酸序列测定
• 4.3 本章小结
• 参考文献
• 第五章 蜡状芽孢杆菌酰胺酶的酶学特性研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 主要实验仪器
• 5.1.2 主要实验试剂
• 5.1.3 蛋白质浓度测定
• 5.1.4 酰胺酶的酶学特性考察
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 pH对酰胺酶酶活的影响
• 5.2.2 不同pH下酰胺酶的稳定性研究
• 5.2.3 酰胺酶的最适反应温度研究
• 5.2.4 酰胺酶的热稳定性（半衰期）研究
• 5.2.5 各种金属离子与化学试剂对酰胺酶的影响
• 5.2.6 底物浓度对酰胺酶活性的影响
• 5.2.7 底物特异性研究
• 5.2.8 酰胺酶的基本动力学常数的测定
• 5.3 本章小结
• 参考文献
• 第六章 总结与建议
• 6.1 本论文的主要结论
• 6.2 本论文的展望
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文和专著