盐芥（Thellungiella halophila）基因组文库的构建及脯氨酸代谢相关基因的克隆与筛选

论文摘要

拟南芥一直是研究植物分子生物学途径的最好模式系统，但拟南芥是真正的甜土植物，因此，使用拟南芥将只能揭示关于植物耐盐性较少的信息。最近，另一个盐生植物盐芥被提议为研究植物耐盐性的模式系统，它是拟南芥的近缘，为生长周期短、基因组较小、耐盐性较强的十字花科的盐生植物；在cDNA水平上与拟南芥有大约90-95％的同源性，因此，可以方便地将拟南芥的很多信息移至盐芥耐盐性的分子生物学研究；而且，盐芥具有拟南芥很多同样的优点以作为实验系统。本论文的目的在于对盐芥这一新的耐盐模式植物在其耐盐机理上做一些探索性的研究。植物在抗盐中，除了可以吸收和积累大量的无机盐离子(主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42-、NO3-等)进行渗透调节适应盐渍环境外，还可以在细胞中合成大量不同的有机物。已经证明高浓度的脯氨酸对一些酶类没有任何抑制作用，正因为如此，高等植物（盐生植物和非盐生植物）在盐渍条件下，可以积累大量的脯氨酸作为渗透剂。脯氨酸作为渗透调节剂对植物体细胞渗透势的变化起重要作用：一，在盐胁迫下，脯氨酸在植物体内是一种重要的渗透调节剂，它是一些高等植物和绿藻抗盐和抗旱的主要渗透剂之一；二，脯氨酸可以保护细胞中的生物大分子的结构，使之不被NaCl破坏，并能维持其完整的水合范围；三，脯氨酸的高度溶解性以及其对植物各种酶活性不抑制性，可以扩大细胞的溶解容积，从而降低细胞质液中盐的浓度，减轻盐的胁迫作用；四，细胞质中积累的大量脯氨酸可以防止液泡对细胞质的脱水作用；五，在盐胁迫下，植物叶绿素的合成受到抑制，叶绿素的合成需要脯氨酸。本实验成功构建了盐芥的基因组文库以及克隆了脯氨酸代谢通路中几个关键的基因：ThP5CS1、2，ThP5CDH，ThPDH，ThERD5。对研究盐芥这种新型抗盐模式植物以及脯氨酸的功能将起到重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 实验论文
• 第一章 盐芥（Thellungiella halophila）基因组文库的构建
• 一、实验材料与方法
• 1、实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种、质粒和噬菌体
• 1.3 酶、药品及试剂盒
• 1.4 培养基及化学试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 盐芥（Thellungiella halophila）基因组DNA的提取
• 2.1.1 CTAB抽提法
• 2.1.2 Dellaporta法分离总基因组DNA
• 2.2 Sau3AI酶切消化盐芥基因组DNA
• 2.3.浓缩酶切后的盐芥基因组DNA
• 2.4 插入基因组DNA片段的准备
• 2.5 待插入DNA与λ-DNA载体的连接
• 2.6 盐芥基因组DNA的包装
• 2.6.1 包装蛋白的选取
• 2.6.2 包装
• 2.7 噬菌体文库滴度的测定
• 2.7.1 试剂准备
• 2.7.2 宿主菌的准备
• 2.7.3 铺板
• 2.8 盐芥基因组的扩大
• 二、实验结果
• 1.盐芥基因组DNA提取结果
• 2.盐芥基因组Sau3AI酶切及浓缩结果
• 3.酶切基因组添平处理结果
• 4.盐芥基因组文库滴度的测定
• 4.1 铺板结果
• 4.2 滴度测定结果
• 第二章:盐芥脯氨酸代谢相关基因片段（ThP5CS1、2,ThP5CDH,ThPDH,ThERD5）的克隆
• 一、实验材料及实验方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒及菌种
• 1.3 酶及化学试剂
• 1.4 主要仪器与设备
• 1.5 质粒提取液
• 1.6 培养基
• 1.7 相关引物序列
• 1.8 软件
• 2 实验方法
• 2.1 RNeasy Plant Mini Kit提取植物总RNA及DNA酶消化
• 2.2 RNA的定量
• 2.3 RNA的反转录及cDNA模板的稀释
• 2.4 PCR扩增ThP5CDH,ThPDH、ThERD5、ThP5CS2基因片段（探针的制备）
• 2.4.1 PCR扩增ThP5CDH基因片段
• 2.4.2 PCR扩增ThPDH基因片段
• 2.4.3 PCR扩增ThERD5基因片段
• 2.4.4 PCR扩增ThP5CS2基因片段
• 2.4.5 酶切得到ThP5CS1基因片段
• 2.5 Gene Clean方法从琼脂糖凝胶上回收外源基因片段
• 2.6 克隆得到的外源基因片段与载体的连接
• 2.7 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 2.8 质粒的提取
• 2.9 PCR、酶切验证
• 二、实验结果
• 1 各外源基因片段的测序结果
• 三、讨论
• 第三章 盐芥脯氨酸代谢相关基因在盐芥基因组文库中的筛选
• 一、实验材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 探针及所需文库
• 1.2 酶及化学试剂
• 1.3 质粒及菌种
• 1.4 实验仪器及设备
• 1.5 培养基
• 1.6 质粒提取液
• 2 实验方法
• 2.1 探针的制备
• 2.2 各种试剂的准备
• 2.3 噬菌体基因组文库的筛选
• 二、实验结果
• 三、讨论
• 1 盐芥基因组文库构建对盐芥基因功能研究有重要的意义
• 2 文库构建过程中遇到的问题及解决方案
• 四、后续工作
• 第二部分:文献综述
• 1 盐芥（Thellungiella halophila）—新型耐盐模式植物
• 2 活性氧的产生和清除机制
• 2.1 氧的活化
• 2.2 活性氧的产生位点及相应的降低活性氧产生的机制
• 2.3 活性氧的清除机制
• 2.3.1 活性氧的酶促清除机制
• 2.3.1.1 超氧化物歧化酶（SOD）
• 2.3.1.2 抗坏血酸过氧化物酶（APX）
• 2.3.1.3 过氧化氢酶（CAT）
• 2.3.1.4 过氧还蛋白（peroxidoxin,Prx）
• 2.3.2 非酶促清除机制
• 2.3.2.1 抗坏血酸（Asc）
• 2.3.2.2 谷胱甘肽
• 2.3.2.3 生育酚
• 2.3.2.4 类胡萝卜素
• 3 结论和展望
• 参考文献
• 致谢