Puroindoines基因反义载体构建和转化及过量表达载体转基因小麦的遗传鉴定

论文摘要

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状。控制硬度的主效基因Pina 和Pinb 位于染色体5D 短臂上,软质对硬质为显性。当Pina 和Pinb 为野生型时（Pina-D1a 和Pinb-D1a）,小麦籽粒为软质;当Pina 基因不表达（Pinb-D1a）或Pinb 基因发生突变时（Pinb-D1）,小麦籽粒则表现为硬质。本研究目的是通过转基因技术,进一步明确Pina 和Pinb 的功能,并为将来通过基因工程方法快速改良我国现有小麦优良品种的籽粒硬度奠定基础。利用含有Ubi 启动子、Bar 表达盒的基础质粒pAHC25,构建了含有Pina、Pinb 基因的植物反义表达载体pAHantipA 和pAHantipB,其中pAHantipA 和pAHantipB 分别载有小麦籽粒硬度Pina、Pinb 基因的反向序列,可用于小麦遗传转化。利用花粉管通道法将其转入软质小麦品种京411（Pina-D1a 和Pinb-D1a）中,分别获得转基因植株9 株和5 株,T1代转基因植株的抗性筛选及PCR检测结果表明,转化率分别为1.4%和0.9%。基因组DNA 斑点杂交证实了外源基因在受体小麦基因组中的整合。利用花粉管通道法,分别将含有Pina 和Pinb 基因的植物高效表达载体pUBPa 和pUBPb 导入小麦品种中优9507（Pinb-D1b）,获得转基因植株。抗性筛选及分子检测分别证实外源Pina、Pinb基因的整合。T1代转基因植株的抗性筛选及PCR 检测结果表明,两个基因的转化频率分别为2.2%和2.0%。对T2代转基因植株的抗性筛选及分子检测结果进行遗传鉴定,确定了两个稳定纯合株系。Friabilin 蛋白检测表明,Puroindolines 基因已在蛋白水平上成功表达,受体植株籽粒硬度表现不尽相同。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦籽粒硬度及其分子生物学基础
• 1.1.1 硬度的遗传学研究
• 1.1.2 Friabilin 蛋白
• 1.1.3 Puroindoline 蛋白
• 1.1.4 Pina 和Pinb 基因功能验证
• 1.1.5 展望
• 1.2 小麦转基因研究进展
• 1.2.1 基因枪法
• 1.2.2 农杆菌介导法
• 1.2.3 花粉管通道法
• 1.2.4 基因表达调控元件的作用及载体构建策略
• 1.2.5 转基因植株筛选
• 1.2.6 外源基因的表达和遗传
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 基因及质粒载体
• 2.1.2 受体小麦品种及菌株
• 2.1.3 试剂及耗材
• 2.1.4 人工合成的寡核苷酸片段
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 载体构建
• 2.2.2 花粉管通道介导法转化小麦及抗性筛选
• 2.2.3 转基因植株的分子鉴定
• 2.2.4 转基因植株的friabilin 蛋白分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 Pina 与 Pinb 基因小麦反义表达载体的构建
• 3.1.1 基础质粒pAHC25 的酶切图谱及鉴定
• 3.1.2 反义表达载体pAHantipA 的构建及其酶切鉴定
• 3.1.3 反义表达载体pAHantipB 的构建及鉴定
• 3.2 转反义载体pAHantipA、pAHantipB 基因小麦的初步鉴定
• 3.2.1 转化植株的获得及其后代Basta 筛选
• 3.2.2 转基因植株的PCR 检测
• 3.2.3 转基因植株的DNA Dot blot 分析
• 3.3 转过量表达载体pUBPa、pUBPb 基因小麦的鉴定
• 3.3.1 转化后代Basta 筛选
• 3.3.2 转基因植株的PCR 检测
• 3.3.3 转基因植株的Southern blot 分析
• 3.3.4 转化后代的friabilin 蛋白分析
• 第四章 讨论
• 4.1 硬度转基因研究
• 4.2 花粉管通道法介导的遗传转化
• 4.3 反义RNA 在小麦Puroindolines 基因功能验证中的作用
• 4.4 过量表达载体转基因植株后代遗传鉴定
• 第五章 结论
• 5.1 反义载体pAHantipA 和pAHantipB 的构建及转基因小麦的获得
• 5.2 过量表达载体转基因植株的鉴定
• 5.3 过量表达载体转基因植株中friabilin 的检测
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢