谷物木聚糖酶抑制蛋白的研究

论文摘要

木聚糖酶在谷物加工工业中有重要应用,然而一些谷物中存在的木聚糖酶抑制蛋白,它能阻碍木聚糖酶活性的发挥,降低木聚糖酶应用效率。本实验对不同谷物籽粒木聚糖酶和木聚糖酶抑制蛋白的分布特征进行了研究,并从小麦品种郑麦366幼胚中克隆得到木聚糖酶抑制蛋白基因taxi-Ⅰ,并分别在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中进行表达。结果如下:（1）谷物籽粒中木聚糖酶及木聚糖酶抑制蛋白对其种子保存和萌发都有重要作用,本实验就小麦、大麦、黑麦、绿粒小麦、荞麦、燕麦、玉米、水稻和高粱九种常见的谷物为材料,研究了籽粒内源木聚糖酶活性及木聚糖酶抑制蛋白活性。结果表明,内源木聚糖酶活性在玉米中较高,在其它谷物中较低;木聚糖酶抑制蛋白活性则在小麦、黑麦、绿麦和荞麦中较高,在大麦中较低,燕麦、玉米、水稻和高粱中没有发现木聚糖酶抑制蛋白活性。作者进一步选取木聚糖酶抑制蛋白活性较高的小麦、黑麦和绿粒小麦,分别测定其种皮、胚和胚乳中的内源木聚糖酶酶活及木聚糖酶抑制蛋白活性。结果表明,胚中的内源木聚糖酶活性高于种皮和胚乳;木聚糖酶抑制蛋白活性在胚和胚乳中基本持平,并且远高于种皮。（2）小麦木聚糖酶抑制蛋白taxi-Ⅰ基因的克隆:提取郑麦366籽粒幼胚中的RNA,利用RT-PCR得到cDNA,将其作为模板,根据GeneBank中已知的成熟小麦木聚糖酶抑制蛋白的基因序列设计引物克隆得到taxi-Ⅰ基因,将测序结果与已知序列比对,同源性100%。（3）木聚糖酶抑制蛋白taxi-Ⅰ基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达:将taxi-Ⅰ基因构建到原核表达载体pET-30a（+）上,转入E.coli BL21（DE3）获得重组菌株,但未检测出外源蛋白的表达。将taxi-Ⅰ基因构建到载体pPIC9K上,利用酿酒酵母α因子信号肽使其在巴斯德毕赤酵母GS115中表达。SDS-PAGE和木聚糖酶抑制蛋白活性检测证实,小麦taxi-Ⅰ基因在毕赤酵母中得到活性表达。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 木聚糖酶研究
• 1.1.1 木聚糖
• 1.1.2 木聚糖酶概述
• 1.1.3 木聚糖酶理化性质
• 1.1.4 木聚糖酶的分类
• 1.1.5 木聚糖酶结构
• 1.1.6 木聚糖酶的应用
• 1.1.6.1 木聚糖酶在饲料工业中的应用
• 1.1.6.2 木聚糖酶在造纸和制浆中的应用
• 1.1.6.3 木聚糖酶在食品工业中的应用
• 1.1.6.4 木聚糖酶的其它应用
• 1.2 木聚糖酶抑制蛋白
• 1.2.1 木聚糖酶抑制蛋白概述
• 1.2.2 木聚糖酶抑制蛋白分布
• 1.2.3 木聚糖酶抑制蛋白性质
• 1.2.3.1 基本性质
• 1.2.3.2 抑制特性
• 1.2.4 木聚糖酶抑制蛋白对木聚糖酶的抑制机理
• 1.3 木聚糖酶抑制蛋白对谷物抵御病原菌中的意义
• 1.4 木聚糖酶抑制蛋白对木聚糖酶应用领域的影响
• 1.4.1 面包焙烤
• 1.4.2 谷朊粉-淀粉分离
• 1.4.3 动物饲料
• 1.4.4 啤酒生产
• 1.4.5 生物化学工具
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 谷物
• 3.1.2 菌株和载体
• 3.1.3 试剂与药品
• 3.1.4 仪器设备
• 3.1.5 培养基
• 3.2 有关试验的操作流程
• 3.2.1 谷物籽粒中粗蛋白提取
• 3.2.2 小麦木聚糖酶抑制蛋白taxi-Ⅰ基因的克隆
• 3.2.3 小麦木聚糖酶抑制蛋白基因在大肠杆菌中的表达
• 3.2.4 小麦木聚糖酶抑制蛋白基因在毕赤酵母中的表达
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 谷物籽粒中粗蛋白的提取
• 3.3.2 谷物不同部位粗蛋白的提取
• 3.3.3 谷物籽粒及其不同部位木聚糖酶活性的测定
• 3.3.4 重组酵母木聚糖酶的制备
• 3.3.5 谷物籽粒中木聚糖酶抑制活性的测定
• 3.3.6 总RNA 的提取
• 3.3.7 RT-PCR
• 3.3.8 重组载体的构建
• 3.3.9 制备和转化感受态大肠杆菌
• 3.3.10 阳性转化子的筛选
• 3.3.11 目的基因在大肠杆菌中的表达检测
• 3.3.12 表达产物的纯化
• 3.3.13 毕赤酵母感受态细胞的制备
• 3.3.14 毕赤酵母细胞的电击转化
• 3.3.15 G418 压力筛选高拷贝转化子
• 3.3.16 目的基因在毕赤酵母中的表达检测
• 4 结果与分析
• 4.1 不同谷物籽粒木聚糖酶及木聚糖酶抑制蛋白的分布特征
• 4.1.1 不同谷物的木聚糖酶及木聚糖酶抑制蛋白活性
• 4.1.2 小麦、黑麦和绿粒小麦不同部位的木聚糖酶及木聚糖酶抑制蛋白活性
• 4.2 小麦木聚糖酶抑制蛋白基因的克隆
• 4.2.1 小麦幼胚总RNA
• 4.2.2 RT-PCR 扩增taxi-Ⅰ基因
• 4.2.3 taxi-Ⅰ基因的TA 克隆及序列分析
• 4.3 木聚糖酶抑制蛋白基因的原核表达
• 4.3.1 pET30a- taxi-Ⅰ重组载体的构建
• 4.3.2 pET-30a- taxi-Ⅰ表达产物检测结果
• 4.4 木聚糖酶抑制蛋白基因的真核表达
• 4.4.1 pMD19-taxi-Ⅰ重组载体的构建
• 4.4.2 pPIC9K-taxi-Ⅰ重组载体的构建
• 4.4.3 pPIC9K-taxi-Ⅰ转化毕赤酵母GS115
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 不同谷物籽粒木聚糖酶及木聚糖酶抑制蛋白分布情况与已报道的差异
• 5.2.2 taxi-Ⅰ基因在原核中未见表达的原因
• 5.2.3 taxi-Ⅰ基因在毕赤酵母中表达量低的原因
• 5.3 前景展望
• 参考文献
• ABSTRACT