β2受体的表达、纯化及在快速检测中的应用

论文摘要

β2肾上腺素能受体激动剂（β2激动剂）的非法滥用一直是畜产品安全问题的焦点之一。从盐酸克仑特罗,到莱克多巴胺、齐帕特罗,再到斑布特罗,β2激动剂类药物不断更新。一种β2激动剂类药物刚得到控制,又会出现新的药物,畜牧生产中非法使用β2激动剂的现象屡禁不止,因畜产品中残留而造成消费者中毒事件时有发生。因此,在监控中迫切需要能够建立β2激动剂类药物多残留的快速筛选检测技术。β2激动剂的作用机理是能够被体内的受体蛋白识别,并引发一系列生理反应,因此β2肾上腺素能受体（β2AR）是一种可以识别各种β2激动剂的蛋白,其与β2激动剂的结合具有特异性和高亲和性。本研究利用本实验室克隆的大仓鼠肺细胞β2AR基因分别在原核及哺乳动物细胞中进行外源表达并纯化,将受体作为识别所有β2激动剂的元件代替抗体,组成受体-β2激动剂-酶反应系统,为β2激动剂的多残留检测提供研究基础。通过大肠杆菌原核细胞表达N端融合麦芽糖结合蛋白（MBP）,C端融合组氨酸标签（6his）的β2AR重组蛋白。构建三个原核表达载体,pMAL-p2x-β2AR（SX）,pMAL-p2x-β2AR（EX）,pMAL-p2x -β2AR（EX-62）,SX为蛋白酶稳定型载体,EX为表达全长蛋白,EX-62为截去N端62个氨基酸的截短蛋白。经SDS-PAGE,Western blotting检测融合蛋白得到表达,将表达全细胞经放射性配基（125I标记的β拮抗剂-氰心得静,ICYP）检测显示蛋白具有与ICYP结合的活性,并且这种结合活性被β2激动剂特异性抑制。用检测克仑特罗的ELISA试剂盒测定三种表达菌液的中带有的活性蛋白浓度分别为:1.29 pmol/L,2.06 pmol/L,0.99 pmol/L。为了提高蛋白活性及表达量,在哺乳动物细胞中表达融合绿色荧光蛋白（GFP）的重组蛋白。表达细胞选择人胚胎肾细胞HEK293,分别建立自表达及诱导表达系统。构建自表达载体pCDNA3.1+-β2AR-GFP,N端融合6His标签,C端融合GFP蛋白,瞬时转染HEK293细胞,可以检测到蛋白表达,融合蛋白具有绿色荧光性,并经SDS-PAGE,Western blotting检测有特异性蛋白表达。但是无法筛选稳定转染细胞。为了获得稳定表达β2AR的稳定细胞株,建立四环素诱导的表达系统。筛选稳定转染单克隆细胞,扩大培养后,加入四环素1μg/mL诱导蛋白表达。经放射性配基ICYP检测显示其具有与ICYP结合的活性,并且这种活性被β2激动剂特异性抑制。为了进一步提高蛋白的表达量,经过受体蛋白疏水性分析,根据蛋白的立体结构,在不影响β2激动剂结合的位点,将疏水氨基酸突变为亲水氨基酸。用套叠PCR法进行基因突变,构建两个突变体:突变体一分别对七个跨膜域氨基酸进行突变,突变体二将二,四,六位氨基酸进行突变。构建突变原核表达载体pMAL-p2x-β2AR1,pMAL-p2x-β2AR2,并对蛋白的原核表达进行初步研究。蛋白纯化方面,细胞经多次超速离心后,使用非离子去垢剂将受体蛋白从细胞膜上解离,原核细胞表达蛋白经Amalso亲和柱纯化,哺乳动物细胞表达蛋白经镍柱纯化,获得纯化的β2AR蛋白。原核表达蛋白1L培养基中纯化受体量为0.198 mg,约占粗膜蛋白的1.67%;哺乳动物细胞从四板细胞培养瓶（15cm）中纯化受体量为0.135 mg,约占膜蛋白的3.8%,结果显示哺乳动物表达的受体蛋白比例高于大肠杆菌表达。经SDS-PAGE和Western blotting检测,纯化后的融合蛋白具有特异结合抗体的能力。使用斑点-ELISA及斑点-酶联配基法,对纯化后β2AR蛋白的配基结合活性进行检测,表明粗膜蛋白及纯化蛋白保持与克仑特罗特异性结合的活性。分别将表达细胞的粗膜蛋白和纯化β2AR受体包被于96孔聚苯乙烯板,以辣根过氧化物酶（HRP）偶联的克仑特罗和游离的克仑特罗,莱克多巴胺及沙丁胺醇构成竞争型检测试剂盒,进行β2激动剂的多残留检测。随着游离克仑特罗等β2激动剂浓度的增加,HRP的酶促显色反应明显得到抑制,而对照组蛋白则无此反应。测定克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇对粗膜蛋白及纯化蛋白的IC50值,说明β2AR受体对不同β2激动剂都有亲和性,但是对克仑特罗的亲和力最强。尿样添加回收实验中,空白尿样添加浓度分别为1 ng/mL,10 ng/mL,100 ng/mL,同时用受体包被酶标板及ELISA试剂盒检测,在受体包被板中添加浓度为1 ng/mL时平均回收率仅达到40%,添加浓度为高浓度时（10 ng/mL,100 ng/mL）回收率达到70%左右,ELISA试剂盒的回收率均达到85%。但是受体检测法用一种试剂盒,一种酶标竞争物,可是检测多种β2激动剂,而ELISA试剂盒则需要多个试剂盒检测多种β2激动剂。影响受体检测结果的因素有很多,包括体外表达蛋白的活性,蛋白的纯化过程中活性的保持以及受体检测方法的摸索,随着研究的深入,受体检测法的优势将远大于免疫分析法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 2肾上腺素能受体激动剂的分子结构特征与危害'>1.1 β₂肾上腺素能受体激动剂的分子结构特征与危害
• 2肾上腺素能受体激动剂的分子结构'>1.1.1 β₂肾上腺素能受体激动剂的分子结构
• 2肾上腺素能受体激动剂的应用与毒性特征'>1.1.2 β₂肾上腺素能受体激动剂的应用与毒性特征
• 2激动剂的快速检测方法研究进展'>1.2 β₂激动剂的快速检测方法研究进展
• 1.2.1 放射免疫技术（RIA）
• 1.2.2 酶免疫分析技术（EIA）
• 1.2.3 抗体芯片技术
• 2肾上腺素能受体研究进展'>1.3 β₂肾上腺素能受体研究进展
• 2肾上腺素能受体蛋白结构及功能特征'>1.3.1 β₂肾上腺素能受体蛋白结构及功能特征
• 1.3.2 G 蛋白偶联受体表达研究进展
• 1.3.3 表达产物的提纯及活性鉴定
• 1.3.4 融合蛋白表达的标签应用
• 1.3.5 提高GPCRs 表达的策略
• 1.4 研究目的与意义
• 1.5 研究技术路线
• 2肾上腺素能受体蛋白体外表达研究'>第二章 β₂肾上腺素能受体蛋白体外表达研究
• 2.1 研究目的
• 2肾上腺素能受体在原核细胞蛋白表达研究'>2.2 β₂肾上腺素能受体在原核细胞蛋白表达研究
• 2.2.1 试剂及仪器
• 2.2.2 研究方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.3 真核表达载体的构建及蛋白表达
• 2.3.1 试剂及仪器
• 2.3.2 研究方法
• 2.3.3 结果与分析
• 2肾上腺素能受体基因的套叠PCR 法多点突变研究'>2.4 大仓鼠β₂肾上腺素能受体基因的套叠PCR 法多点突变研究
• 2.4.1 试剂及仪器
• 2.4.2 研究方法
• 2.4.3 结果与分析
• 2.5 讨论
• 2.5.1 表达系统的选择
• 2.5.2 表达载体的选择
• 2.5.3 提高蛋白表达的策略
• 2.5.4 蛋白的表达及膜蛋白检测
• 2.5.5 受体蛋白活性测定
• 2.5.6 受体蛋白突变研究
• 2.5.7 套叠PCR 法在基因突变中的应用
• 2肾上腺素能受体蛋白的纯化研究'>第三章 β₂肾上腺素能受体蛋白的纯化研究
• 3.1 研究目的
• 3.2 试剂及仪器
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 溶液配制
• 3.2.3 试验设备
• 3.3 研究方法
• 3.3.1 粗膜制备
• 3.3.2 受体蛋白的纯化
• 3.3.3 蛋白的斑点酶联免疫反应法分析
• 3.3.4 蛋白的SDS-PAGE 分析及Western blotting 检测
• 3.3.5 斑点酶联配基反应法（Dot- Enzyme Linked Ligand）测定蛋白活性
• 3.3.6 蛋白浓度测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 斑点酶联免疫反应法检测蛋白
• 3.4.2 SDS-PAGE 及Western blotting 检测蛋白
• 3.4.3 斑点酶联配基法测定蛋白活性
• 3.4.4 纯化蛋白浓度测定
• 3.5 讨论
• 2受体-酶检测试剂盒的初步构建'>第四章 β₂受体-酶检测试剂盒的初步构建
• 4.1 研究目的
• 4.2 试剂及仪器
• 4.2.1 溶液配制
• 4.2.2 仪器设备
• 4.3 研究方法
• 4.3.1 受体的包被
• 4.3.2 酶标克仑特罗的制备
• 2激动剂特异性竞争实验'>4.3.3 受体对不同β₂激动剂特异性竞争实验
• 2激动剂多残留检测方法在尿液检测中的应用'>4.3.4 基于受体的β₂激动剂多残留检测方法在尿液检测中的应用
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 受体-酶多残留检测技术的初步研究
• 4.4.2 受体-酶多残留检测技术的尿样添加回收
• 4.5 讨论
• 4.5.1 以受体为检测试剂的快速筛选方法研究
• 2激动剂快速检测试剂盒的构建'>4.5.2 以受体-酶为基础的β₂激动剂快速检测试剂盒的构建
• 第五章 全文结论
• 2AR 原核表达系统的建立'>1 β₂AR 原核表达系统的建立
• 2AR 哺乳动物细胞表达系统的建立'>2 β₂AR 哺乳动物细胞表达系统的建立
• 2受体基因的突变及表达研究'>3 β₂受体基因的突变及表达研究
• 4 受体蛋白的纯化
• 2激动剂的残留方法的初步应用'>5 受体-酶检测β₂激动剂的残留方法的初步应用
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历