水稻抗稻瘟病基因Pik～m的定位及克隆

论文题目: 水稻抗稻瘟病基因Pik～m的定位及克隆

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 李落叶

导师: 井金学,潘庆华

关键词: 水稻,稻瘟病菌,抗病基因,分子标记,遗传和物理作图,基因克隆,遗传转化

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 由稻瘟病菌Magnaporthe grisea（Hebert）Barr（无性态世代为Pyricularia grisea （Cooke）Sacc.）引起的稻瘟病是广泛发生在世界各稻区的最主要的水稻病害之一,是阻碍水稻高产、稳产的主要因素之一。从根本上来讲,利用抗病品种是防治稻瘟病最经济有效也是对环保友好的措施。然而,往往具有单一抗病基因的水稻品种在广泛种植了一段时间以后就丧失了抗病性,将抗同一病害的不同抗病基因聚合到同一品种中,被认为是获得高水平持久抗病性的重要途径之一。分子标记辅助选择是抗病育种中实现基因聚合的快速而有效的途径,是构建转基因抗病品种的物质基础。另一方面,抗病基因是植物一病原物互作中的一个关键因子,克隆抗病基因是研究植物抗病机制、揭示植物-病原物互作机理和了解寄主与病原菌共进化规律的基础。因此,对抗病基因进行定位,寻找与之连锁的分子标记和克隆抗病基因就变得非常重要。水稻抗稻瘟病基因Pikm对来自泰国、日本和中国的许多稻瘟病菌小种具有稳定的抗病性,为了更好地利用该基因,本研究致力于对Pikm基因的定位和克隆,得到如下结果: 1.Pikm基因的初步定位主效抗性基因Pikm曾经被人用RFLP标记粗略地定位在水稻第11染色体长臂上,本研究在前人研究的基础上,通过构建包含目的基因Pikm的F2代作图群体,利用BSA和RCA相结合的方法,用第11染色体长臂上公开发表的基于PCR技术的已知标记（STS、CAPS、SSR）进行连锁分析,对Pikm基因进行了初步定位。共筛选了19个已知标记,结果表明,6个微卫星标记（RM5926、RM7443、RM2136、RM5766、RM144和RM254）与目的基因连锁,经逼近将Pikm基因定位于标记RM254和RM144之间。 2.Pikm基因的精细定位在初步定位的基础上,根据测序品种Nipponbare的BAC克隆序列,构建了目的区域的电子物理图,并且在目标区域开发了10个新的基于PCR的分子标记（STS、CAPS）,同时进一步扩大作图群体,对目的基因进行了精细定位,最终将Pikm基因定位于标记K10与K34之间0.3cM的区域内,构建了Pikm基因区域的精细遗传图,并且获得3个与目的基因共分离的分子标记:K27、K28、K33。 3.目的区域的基因预测与候选基因的确定利用3种生物信息学软件ORF Finder（http://www.ncbi.nlm nih.gov）、RiceGAAS（Autopredgeneset,http://ricegaas.dna.affrc.go.jp）系统和 Soft Berry（http://www.softberry.com）上的FGENESH对Pikm基因所在区域进行基因预测,搜索具有抗病基因保守结构的候选基因,经过初步遴选后,对候选基因进行RT-PCR分析,进一步确定了候选基因PK1。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 稻瘟病抗病性的遗传基础及抗稻瘟病基因的鉴定

1.2 植物抗病基因的定位和克隆

1.2.1 基因定位

1.2.1.1 常用分子标记技术的原理及特点

1.2.1.2 抗稻瘟病基因的定位及其在水稻基因组中的分布特点

1.2.2 基因克隆

1.2.2.1 图位克隆技术路线及其应用

1.2.2.2 图位克隆技术的发展

1.2.2.3 其它基因克隆方法

1.3 植物抗病基因结构及植物抗病的分子基础

1.3.1 植物抗病基因的结构

1.3.2 植物抗病的分子基础

1.4 现代生物技术在抗病育种中的应用

1.4.1 利用分子标记辅助选择进行抗病育种

1.4.2 利用转基因技术进行抗病育种

1.5 本研究的目的和意义

第二章 Pik~m基因的初步定位

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 植物材料

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要仪器设备

2.2.4 构建作图群体

2.2.5 稻瘟病菌分生孢子的接种和病害调查

2.2.6 标样基因组 DNA的提取

2.2.7 STS标记分析

2.2.8 CAPS标记分析

2.2.9 SSR标记分析

2.2.10 标记筛选及连锁分析

2.2.11 Pik~m基因遗传图的构建

2.3 结果

2.3.1 作图群体的构建

2.3.2 Pik~m基因的初步定位

2.4 讨论

2.4.1 亲本以及病原菌小种的选择对构建作图群体的影响

2.4.2 以 PCR技术为基础的分子标记的选择对结果的影响

第三章 Pik~m基因的精细定位

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 作图群体

3.2.2 主要试剂和仪器设备

3.2.3 基因组 DNA的提取

3.2.4 Pik~m基因区域物理重叠群的构建

3.2.5 SSR标记分析

3.2.6 STS和 CAPS标记分析

3.2.7 Pik~m基因区域精细遗传图的构建

3.2.8 Pik~m基因区域物理图的构建

3.3 结果

3.3.1 Pik~m基因区域物理重叠群的构建

3.3.2 Pik~m基因的精细定位

3.4 讨论

3.4.1 目的基因区域新标记的开发

3.4.2 抗病基因所在区域的连锁不平衡

第四章 Pik~m目标区域的基因预测及候选基因的确定

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 植物材料

4.2.2 主要试剂药品

4.2.3 主要仪器设备

4.2.4 目标区域的基因预测和序列分析

4.2.5 候选基因的 RT-PCR分析

4.3 结果

4.3.1 目标区域的基因预测

4.3.2 候选基因的确定

4.3.3 候选基因的 RT-PCR分析

4.4 讨论

第五章 Pik~m候选基因的克隆及序列分析

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 植物材料

5.2.2 菌株

5.2.3 主要试剂

5.2.4 主要仪器设备

5.2.5 培养基配方

5.2.6 序列分析软件

5.2.7 候选基因 PK1全长cDNA序列的获得

5.2.7.1 cDNA的分段扩增

5.2.7.2 大肠杆菌感受态细胞的制备

5.2.7.3 目的片段的回收

5.2.7.4 目的片段与载体的连接

5.2.7.5 连接产物电击转化大肠杆菌

5.2.7.6 阳性克隆的鉴定和保存

5.2.7.7 序列拼接

5.2.8 候选基因 PK1的克隆和测序

5.2.9 候选基因 PK1全长cDNA序列的扩增和克隆

5.3 结果

5.3.1 候选基因 PK1全长cDNA序列的获得及其功能预测

5.3.2 候选基因 PK1的扩增、克隆及序列分析

5.3.3 候选基因 PK1全长cDNA的扩增及克隆

5.4 讨论

5.4.1 关于基因克隆的策略

5.4.2 关于候选基因 PK1编码的蛋白质

第六章 Pik~m候选基因的遗传转化

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 植物材料

6.2.2 载体和菌株

6.2.3 主要试剂

6.2.4 主要仪器设备

6.2.5 培养基配方及相关溶液的配置

6.2.6 候选基因 PK1的cDNA序列的克隆

6.2.7 电击转化大肠杆菌

6.2.8 重组质粒的提取和鉴定

6.2.9 重组质粒转化农杆菌

6.2.10 农杆菌介导的植物遗传转化

6.2.11 转化苗的早期鉴定

6.3 结果

6.3.1 候选基因 PK1全长cDNA的克隆和鉴定

6.3.2 转化质粒在农杆菌中的稳定性检测

6.3.3 植物遗传转化和转基因植株的获得

6.3.4 T_0代转化植株的初步鉴定

6.4 讨论

6.4.1 关于目的片段的克隆

6.4.2 转基因效率的问题

6.4.3 进一步研究的设想

第七章结论

参考文献

附录

致谢

作者简介

发布时间: 2007-04-06

参考文献

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