论文摘要
卵巢癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤,在妇科恶性肿瘤中死亡率居于首位,其主要特征是肿瘤细胞的恶性生长、转移及复发。目前卵巢癌治疗以手术和放化疗为主,但由于卵巢癌早期诊断困难,晚期治疗效果差,术后容易复发,常规的治疗方法难以明显提高患者,特别是晚期患者的远期生存率,因此,寻找一种新的方法来改善卵巢癌病人的预后,提高五年生存率已经迫在眉睫,而卵巢癌的生物治疗已经成为近年来卵巢癌治疗的研究热点。白细胞介素12（interleukin-12, IL-12）是目前公认的最有效的抗肿瘤细胞因子之一,利用IL-12重组载体进行肿瘤的基因治疗极具前景。人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs）易于外源基因的导入与表达,作为抗肿瘤细胞基因治疗负载体系极具优越性。通过转基因的方法,将抗肿瘤细胞因子IL-12转入新型的基因治疗有效靶向载体UC-MSCs,为卵巢癌的治疗提供了新的途径。本研究以UC-MSCs作为基因治疗的靶向运载工具,构建UC-MSCs负载IL-12重组腺病毒载体（AdIL-12-MSCs）,观察AdIL-12-MSCs对卵巢癌SKOV3细胞生长形态、体外增殖及凋亡的影响;建立人卵巢癌细胞系SKOV3裸鼠移植瘤模型,观察外源性IL-12对卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤生长和血管生成的影响,建立小鼠卵巢癌细胞系OVHM移植瘤模型,观察外源性IL-12对卵巢癌OVHM移植瘤的预防、肿瘤生长、淋巴管和血管生成的影响,研究化疗联合基因治疗在卵巢癌综合治疗中的疗效及UC-MSCs作为抗肿瘤基因治疗负载体系的可行性,进一步探讨AdIL-12-MSCs抗卵巢癌的作用,为卵巢癌的基因治疗提供新靶向。第一部分IL-12基因修饰人脐带间充质干细胞抗卵巢癌SKOV3细胞作用的研究目的:观察UC-MSCs和AdIL-12-MSCs对卵巢癌SKOV3细胞生长形态、体外增殖及凋亡的影响,探讨AdIL-12-MSCs对卵巢癌的疗效,研究UC-MSCs作为基因治疗的靶向运载工具的可行性。方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞和人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）,以UC-MSCs作为基因治疗的靶向运载工具,构建UC-MSCs负载IL-12重组腺病毒载体（AdIL-12-MSCs）。采用Western Blotting检测AdIL-12-MSCs中IL-12蛋白的表达,RT-PCR检测AdIL-12-MSCs中IL-12 mRNA的表达,ELISA法检测AdIL-12-MSCs上清液中IL-12的表达。光镜下观察UC-MSCs、AdIL-12-MSCs上清液对SKOV3细胞生长及形态的影响,MTT法检测UC-MSCs、AdIL-12-MSCs上清液对SKOV3细胞增殖的影响,流式细胞仪检测UC-MSCs、AdIL-12-MSCs上清液对SKOV3细胞凋亡的影响。结果:1、Western Blotting检测表明AdIL-12-MSCs组有IL-12蛋白表达。2、RT-PCR检测表明AdIL-12-MSCs组有IL-12 mRNA表达。3、ELISA显示培养48h后,AdIL-12-MSCs细胞上清液中IL-12的含量为（79.27±18.36） ng/ml。4、设UC-MSCs组、AdIL-12-MSCs组和对照组SKOV3三组细胞,光镜下分别观察三组细胞第24h、48h、72h的生长及形态。UC-MSCs组和AdIL-12-MSCs组均有抑制SKOV3细胞生长的作用;与UC-MSCs组相比,AdIL-12-MSCs组抑制SKOV3细胞生长的作用更加明显,且抑制作用随着时间的增加而增强。5、MTT法检测三组细胞24、48h、72h体外增殖的情况。随着时间的延长,UC-MSCs组、AdIL-12-MSCs组抑制SKOV3细胞增殖的能力显著提高;与UC-MSCs组相比,AdIL-12-MSCs组抑制SKOV3细胞增殖的作用更加明显,差异有统计学意义（P<0.05）。6、流式细胞仪检测三组细胞的凋亡情况。UC-MSCs组无明显促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡的作用（P>0.05）;AdIL-12-MSCs组SKOV3细胞的凋亡率为（9.72±1.38）%,与UC-MSCs组SKOV3细胞的凋亡率（2.69±0.45）%相比,凋亡率显著增高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:本研究成功构建了AdIL-12-MSCs细胞系,其分泌的外源性IL-12能够显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,促进细胞凋亡;与UC-MSCs相比,AdIL-12-MSCs抑制SKOV3细胞生长的作用更加明显,且抑制作用随着时间的增加而增强;UC-MSCs作为抗肿瘤基因治疗负载体系具有可行性。第二部分IL-12基因修饰人脐带间充质干细胞抗卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤作用的研究目的:建立人卵巢癌细胞系SKOV3裸鼠移植瘤模型,观察外源性IL-12对移植瘤生长和血管生成的影响,研究化疗联合基因治疗在卵巢癌综合治疗中的疗效及UC-MSCs作为抗肿瘤基因治疗负载体系的可行性,探讨AdIL-12-MSCs抗卵巢癌的作用。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。将裸鼠随机分为7组,每组8只。荷瘤7天后按组别进行尾静脉移植（5日1次）:（1）对照组:0.2ml PBS;（2）UC-MSCs组:1×106个UC-MSCs悬浮于0.2ml PBS;（3）Ad-MSCs组:1×106个Ad-MSCs悬浮于0.2ml PBS;（4）AdIL-12组: 109PFU重组IL-12腺病毒悬浮于0.2ml PBS ;（5）AdIL-12-MSCs组:1×106个AdIL-12-MSCs悬浮于0.2ml PBS;（6）环磷酰胺组:0.2ml PBS尾静脉移植;环磷酰胺100mg/kg腹腔注射每周2次（自肿瘤接种后第8天）;（7）联合组（AdIL-12-MSCs+环磷酰胺）:1×106个AdIL-12-MSCs悬浮于0.2ml PBS尾静脉移植;环磷酰胺100mg/kg腹腔注射每周2次;以上各组治疗连续30天。每3天测量1次皮下移植瘤体的大小,以公式V=πabc/6计算肿瘤体积（V为体积,a、b、c分别为移植瘤互相垂直的直径）,绘制移植瘤的生长曲线。计算肿瘤生长抑制率,抑瘤率（%）=（a-b）/a×100% （a为对照组平均瘤重,b为药物组平均瘤重）。应用流式细胞仪检测各组移植瘤的凋亡率。免疫组化SP法检测各组移植瘤组织中IFN-γ、VEGF、CD34的表达。结果:1、人卵巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤生长曲线:各治疗组均能抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,尤其以联合组抑制肿瘤生长的作用最为明显。2、各组移植瘤瘤重和抑瘤率的比较:各治疗组的瘤重分别与对照组相比、AdIL-12-MSCs组与AdIL-12组相比、联合组与环磷酰胺组相比,均有显著差异（P<0.05）;UC-MSCs组、Ad-MSCs组、AdIL-12组、AdIL-12-MSCs组、环磷酰胺组、联合组对SKOV3皮下移植瘤的抑瘤率分别为14.42%、12.10%、43.81%、59.08%、69.74%、81.84%。3、流式细胞仪检测UC-MSCs组、Ad-MSCs组、AdIL-12组、AdIL-12-MSCs组、环磷酰胺组、联合组移植瘤组织细胞凋亡率分别为（10.02±0.17）%、（9.76±0.25）%、（14.32±1.08）%、（19.25±1.22）%、（22.56±0.32）%、（30.21±0.56）%。各治疗组的凋亡率分别与对照组相比、AdIL-12-MSCs组第二部分IL-12基因修饰人脐带间充质干细胞抗卵巢癌SKOV3裸鼠移与AdIL-12组相比、联合组与环磷酰胺组相比,均有显著差异（P<0.05）。4、AdIL-12-MSCs对移植瘤IFN-γ表达的影响:各组与AdIL-12-MSCs组的IHS比较均有显著差异（P<0.05）;联合组与环磷酰胺组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。AdIL-12-MSCs对IFN-γ蛋白的表达有明显的促进作用。5、AdIL-12-MSCs对移植瘤血管生成的影响:各治疗组VEGF表达的IHS和MVD分别与对照组相比、AdIL-12-MSCs组与AdIL-12组相比、联合组与环磷酰胺组相比,均有显著差异（P<0.05）。AdIL-12-MSCs对移植瘤中VEGF蛋白表达有明显抑制作用,使移植瘤血管生成减少。结论:AdIL-12-MSCs能够抑制人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的生长并诱导其凋亡,其抗肿瘤血管生成作用可能是通过诱导IFN-γ的生成,下调VEGF的表达来实现;AdIL-12-MSCs与化疗药物联合应用使抑瘤作用增强;UC-MSCs作为抗肿瘤基因治疗负载体系具有可行性。第三部分IL-12基因修饰人脐带间充质干细胞抗卵巢癌OVHM移植瘤作用的研究目的:建立小鼠卵巢癌细胞系OVHM移植瘤模型,观察外源性IL-12对卵巢癌OVHM移植瘤的预防、肿瘤生长、淋巴管和血管生成的影响,研究化疗联合基因治疗在卵巢癌综合治疗中的疗效及UC-MSCs作为抗肿瘤基因治疗负载体系的可行性,进一步探讨AdIL-12-MSCs抗卵巢癌的作用。方法:体外培养鼠卵巢癌OVHM细胞,建立卵巢癌皮下移植瘤模型,将小鼠随机分为8组,每组10只。预防组将1×106个AdIL-12-MSC悬浮于0.2ml PBS行腹腔注射,1周后荷瘤,观察成瘤情况。另外7组于荷瘤7天后,按组别轮流进行腹腔注射和尾静脉移植（5日1次）:（1）对照组:0.2ml PBS;（2）UC-MSCs组:1×106个UC-MSCs悬浮于0.2ml PBS;（3）Ad-MSCs组:1×106个Ad-MSCs悬浮于0.2ml PBS;（4）AdIL-12组:109PFU重组IL-12腺病毒悬浮于0.2ml PBS;（5）AdIL-12-MSCs组:1×106个AdIL-12-MSCs悬浮于0.2ml PBS;（6）环磷酰胺组:0.2ml PBS尾静脉移植;环磷酰胺100mg/kg腹腔注射每周2次（自肿瘤接种后第8天）;（7）联合组（AdIL-12-MSCs+环磷酰胺）:1×106个AdIL-12-MSCs悬浮于0.2ml PBS尾静脉移植;环磷酰胺100mg/kg腹腔注射每周2次;以上各组治疗连续30天。每3天测量1次皮下移植瘤体的大小,以公式V=πabc/6计算肿瘤体积（V为体积,a、b、c分别为移植瘤互相垂直的直径）,绘制移植瘤的生长曲线。计算肿瘤生长抑制率,抑瘤率（%）=（a-b）/a×100% （a为对照组平均瘤重,b为药物组平均瘤重）。免疫组化SP法检测各组移植瘤组织中CD4+、CD8+、IFN-γ、LYVE-1和CD31的表达。结果:1、卵巢癌OVHM小鼠皮下移植瘤生长曲线:UC-MSCs和Ad-MSCs不能抑制移植瘤生长,其余各治疗组均能抑制移植瘤的生长,尤其以联合组抑制肿瘤生长的作用最为明显。2、各组移植瘤瘤重和抑瘤率的比较:UC-MSCs和Ad-MSCs不能抑制移植瘤生长,其余各治疗组的瘤重分别与对照组相比、AdIL-12-MSCs组与AdIL-12组相比、联合组与环磷酰胺组相比,均有显著差异（P<0.05）;AdIL-12组、AdIL-12-MSCs组、环磷酰胺组、联合组对SKOV3皮下移植瘤的抑瘤率分别为32.34%、58.42%、68.32%、87.79%。3、治疗组小鼠移植瘤组织的淋巴细胞浸润:AdIL-12-MSCs组和AdIL-12组有较多的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润,其余各组肿瘤组织中CD4+和CD8+浸润则明显减少。4、AdIL-12-MSCs对移植瘤淋巴管生成的影响: AdIL-12-MSCs对LYVE-l蛋白的表达有明显的抑制作用,UC-MSCs对LYVE-l蛋白的表达可能有促进作用,LYVE-1阳性表达的IHS中,各治疗组与对照组相比、AdIL-12-MSCs组与AdIL-12组相比、联合组与环磷酰胺组相比均有显著差异（P<0.05）。5、AdIL-12-MSCs对移植瘤血管生成的影响: IFN-γ表达显示,AdIL-12-MSCs组分别与AdIL-12组、对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）;联合组与环磷酰胺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。AdIL-12-MSCs对IFN-γ蛋白的表达有明显的促进作用。CD31表达显示,UC-MSCs和Ad-MSCs不能抑制移植瘤血管生成,而其余各治疗组的移植瘤中,CD31表达IHS显著降低;AdIL-12-MSCs组与AdIL-12组相比、联合组与环磷酰胺组相比均有显著差异（P<0.05）。AdIL-12-MSCs能够抑制移植瘤血管生成,与化疗药物联用可使抑制血管生成作用增强。6、预防组小鼠皮下移植瘤的生长、淋巴管及血管生成情况:预防组有7只小鼠在接种OVHM细胞后10天左右可见移植瘤形成,肿瘤生长较为平缓,另外3只未见移植瘤形成,小鼠晚期的体重、饮食、活动力及反应力无明显变化;免疫组化结果显示,与对照组相比,预防组移植瘤中CD4+、CD8+及IFN-γ表达升高,LYVE-1和CD31表达降低。结论:AdIL-12-MSCs能够抑制卵巢癌OVHM移植瘤的生长,其抗肿瘤作用可能是通过促进T细胞增殖、诱导IFN-γ的表达,从而抑制卵巢癌移植瘤血管和淋巴管的生成;AdIL-12-MSCs与化疗药物联合应用能使抑瘤作用增强;UC-MSCs作为抗肿瘤基因治疗负载体系具有可行性;AdIL-12-MSCs具有预防肿瘤形成的作用,其机制可能与IL-12能够干扰肿瘤早期血管和淋巴管生成的作用相关。
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