α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究

论文摘要

α-半乳糖苷酶（a-galactosidase,a-D-galactoside galactohydrolase;EC 3.2.1.22）也称蜜二糖酶,属于外切糖苷酶类。可以特异性催化移除不同底物中α-末端连接的非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物、微生物中。而微生物种类繁多、分布广泛、适应性强,因此是α-半乳糖苷酶的主要来源。该酶在食品、饲料、医药工业等领域得到广泛的应用,受到业内的高度重视,被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。本实验从236个土样中筛选到一株α-半乳糖苷酶高产菌株,经16s rDNA鉴定及生理生化鉴定为巨大芽孢杆菌,命名为巨大芽孢杆菌MEPE0049。以棉籽糖为底物测定比酶活为1.22 U/mg。对该菌株的产酶条件,包括装液量,接种量,碳源,氮源,最适温度,最适pH和金属离子对其产酶的影响进行了研究,以找到最适产酶条件,更好的使其产酶。此外,我们还研究了巨大芽孢杆菌MEPE0049粗酶液的最适反应温度、温度稳定性,最适反应pH值、pH值稳定性及金属离子Cu2+,Fe3+,Ca2+,Ni+, Zn2+, Mg2+,Mn2+,Co2+对其酶液反应的影响。结果表明来源于该菌株的α-半乳糖苷酶粗酶液在45℃高温时丧失其活性,且在pH小于5的条件下酶活稳定性较差。大多数金属离子对其活性没有很大影响,只有Co+使酶活性降到30%以下。将Cazy数据库中已登录的α-半乳糖苷酶的序列与巨大芽孢杆菌的总基因组进行比对,得到两个序列。设计四条特异性引物,通过PCR扩增得到大小为1323 bp的agaA基因和大小为2226 bp的agaB基因。将该两段基因连接到pET-29a上,在E.coil BL21中进行表达。重组子pET-29a-agaA粗酶液没测到酶活,而重组子pET-29a-agaB粗酶液比酶活达到9.86 U/mg,将重组子pET-29a-agaB粗酶液进行Ni-NAT柱纯化,纯化后比酶活达到380.66 U/mg。将该酶纯化后,研究其酶学性质,发现和粗酶的酶学性质并无明显区别。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 α-半乳糖苷酶的研究进展
• 1.1 α-半乳糖苷酶的概念
• 1.2 α-半乳糖苷酶的分类
• 1.2.1 按照最适pH值分类
• 1.2.2 按照底物特异性分类
• 1.2.3 按照氨基酸序列分类
• 1.3 α-半乳糖苷酶的来源
• 1.4 α-半乳糖苷酶的生理意义
• 1.5 α-半乳糖苷酶的酶学性质
• 1.5.1 α -半乳糖苷酶的催化特性
• 1.5.2 α-半乳糖苷酶酶活测定方法
• 1.5.3 α-半乳糖苷酶的最适反应条件
• 1.5.4 α-半乳糖苷酶的分子特性
• 2 α-半乳糖苷酶的应用
• 2.1 α-半乳糖苷酶在食品工业上的应用
• 2.2 α-半乳糖苷酶在制糖工业上的应用
• 2.3 α-半乳糖苷酶在饲料工业上的应用
• 2.4 α-半乳糖苷酶在化学工业上的应用
• 2.5 α-半乳糖苷酶在造纸工业上的应用
• 2.6 α-半乳糖苷酶的医学研究进展
• 2.6.1 α-半乳糖苷酶与Fabry疾病的研究进展
• 2.6.2 α-半乳糖苷酶与血型转换的研究进展
• 2.6.3 α-半乳糖苷酶与异种器官移植的研究进展
• 参考文献
• 第二章 α-半乳糖苷酶高产菌的筛选、鉴定及其粗酶液的特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌株的分离
• 1.3 比酶活测定
• 1.4 菌株MEPE0049的鉴定
• 1.4.1 16S rDNA基因的PCR扩增
• 1.4.2 测序验证
• 1.4.3 生理生化鉴定
• 1.5 产酶条件测定
• 1.5.1 最适产酶装液量测定
• 1.5.2 最适产酶接种量测定
• 1.5.3 最适产酶碳源测定
• 1.5.4 最适产酶N源测定
• 1.5.5 最适产酶温度测定
• 1.5.6 最适产酶pH测定
• 1.5.7 金属离子对产酶的影响
• 1.6 粗酶液特性测定
• 1.6.1 最适反应pH值测定
• 1.6.2 最适反应温度测定
• 1.6.3 pH值稳定性测定
• 1.6.4 热稳定性测定
• 1.6.5 金属离子对酶活的影响
• 2 实验结果与分析
• 2.1 菌种分离
• 2.2 比酶活的测定
• 2.3 菌种鉴定
• 2.3.1 生理生化鉴定
• 2.3.2 系统发育分析
• 2.4 巨大芽孢杆菌MEPE0049产酶特性研究
• 2.4.1 最适产酶装液量测定
• 2.4.2 最适产酶接种量测定
• 2.4.3 最适产酶C源测定
• 2.4.4 最适产酶N源测定
• 2.4.5 最适产酶温度测定
• 2.4.6 最适产酶pH测定
• 2.4.7 金属离子对产酶的影响
• 2.5 α-半乳糖苷酶粗酶液酶学性质的研究
• 2.5.1 粗酶液最适反应pH值和pH值稳定性
• 2.5.2 粗酶液反应的最适温度及温度稳定性
• 2.5.3 金属离子对α-半乳糖苷酶活性的影响
• 3 本章小结与讨论
• 参考文献
• 第三章 巨大芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达、纯化及其酶学性质研究
• 第一节 巨大芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达、纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养条件
• 1.3 试剂
• 1.4 抗生素及使用浓度
• 1.5 引物合成
• 1.6 表达载体构建
• 1.6.1 巨大芽孢杆菌MEPE0049总DNA的提取
• 1.6.2 α-半乳糖苷酶基因的PCR扩增
• 1.6.3 PCR产物的纯化
• 1.6.4 PCR产物加A尾
• 1.6.5 酶连
• 2法）'>1.6.6 感受态的制备（CaCl₂法）
• 1.6.7 酶连产物的转化
• 1.6.8 质粒DNA的小量提取
• 1.6.9 基因片段的NdeⅠ/XhoⅠ双酶切及纯化
• 1.6.10 pET-29a（+）的NdeⅠ/XhoⅠ双酶切及纯化
• 1.6.11 目的基因与pET-29a（+）载体的酶连
• 1.6.12 酶连产物的转化和表达菌株的构建
• 1.6.13 表达菌株的活性验证及测序验证
• 1.7 α-半乳糖苷酶基因agaB的表达
• 1.8 α-半乳糖苷酶的纯化
• 1.9 SDS聚丙烯酰胺凝胶制备、电泳及凝胶的染色、脱色
• 1.9.1 样品的处理
• 1.9.2 聚丙烯酰胺凝胶的灌制
• 1.9.3 电泳
• 1.9.4 凝胶的染色、脱色
• 1.10 α-半乳糖苷酶比酶活力测定
• 1.10.1 硝基苯酚-α-D-半乳糖苷（pNPG）方法
• 2 结果与分析
• 2.1 巨大芽孢杆菌MEPE0049总DNA的提取
• 2.2 糖苷酶基因的扩增和TA克隆
• 2.2.1 α-半乳糖苷酶基因的扩增
• 2.2.2 T-A克隆
• 2.2.3 表达载体的构建
• 2.3 α-半乳糖苷酶基因的表达纯化
• 2.4 α-半乳糖苷酶AgaB的比酶活的测定
• 2.4.1 硝基苯酚-α-D-半乳糖苷（pNPG）方法
• 第二节 α-半乳糖营酶AgaB酶学性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养条件
• 1.3 温度和pH值对α-半乳糖苷酶AgaB活性及稳定性的影响
• 1.3.1 AgaB的最适反应pH值测定
• 1.3.2 AgaB的最适反应温度测定
• 1.3.3 AgaB的pH值稳定性测定
• 1.3.4 AgaB的热稳定性测定
• 1.4 金属离子对α-半乳糖苷酶AgaB活性的影响
• 1.5 α-半乳糖营酶AgaB的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）
• 2 结果与分析
• 2.1 温度和pH值对α-半乳糖苷酶AgaB活性和稳定性的影响
• 2.1.1 纯化后酶液反应的最适pH值
• 2.1.2 纯化后酶液反应的pH值稳定性
• 2.1.4 纯化后酶液反应的温度稳定性
• 2.1.5 金属离子对α-半乳糖苷酶AgaB活性的影响
• 2.1.6 α-半乳糖苷酶AgaB的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）
• 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 创新之处
• 附录
• 致谢