牙鲆rag基因的克隆及表达研究

论文摘要

牙鲆在中国北方沿海地区形成了大规模的工厂化养殖,成为我国海水养殖的一大重要产业。然而疾病的频繁发生严重阻碍了这一产业的发展,为了保证牙鲆产业稳定、健康、持续地发展,开展鱼类免疫系统的基础研究,提高鱼类抵抗病原菌侵害的能力,本研究从牙鲆免疫系统的个体发育过程入手,克隆了其rag（recombination activating gene）基因,在此基础上对其组织特异性表达进行了分析。研究结果表明牙鲆rag1基因由4个外显子和3个内含子组成,第一个外显子位于5’非翻译区,这一外显子存在两种不同的剪切方式。牙鲆rag1基因编码1068个氨基酸。牙鲆rag2基因的编码区序列长为1602 bp,编码533个氨基酸,没有在牙鲆rag2基因编码区内发现内含子的存在。rag基因间序列长为3128 bp,两个基因共用一段3’非编码区。本试验通过RT-PCR检测发现,牙鲆的rag1和rag2基因在头肾和体肾中均有表达。整装原位杂交结果表明,牙鲆在受精后第8天开始起有rag1和rag2基因的表达,主要在胸鳍前面,腮背部的部位表达,这个区域与后来胸腺出现的位置相一致。冰冻切片结果显示,rag是在靠近咽部的区域有表达。石蜡切片原位杂交结果显示,rag基因在胸腺中的表达显示出不均一性,着色较深的为皮层区,而着色比较浅的为髓部。将牙鲆rag1基因的一部分（编码559个氨基酸）和rag2全基因序列（编码533个氨基酸）插入到表达质粒pProEXTM HTa上,在大肠杆菌E. coli BL-21中进行体外表达与分析,结合BD TALONTM Metal Affinity Resins亲和柱纯化了RAG2蛋白。

论文目录

• 第一章 引言
• 一、鱼类免疫系统组成及其个体发育
• 1 鱼类的免疫器官和组织
• 2 免疫细胞
• 3 体液免疫因子
• 4 鱼类免疫系统的个体分子发育
• 二、抗原受体的结构及功能多样性产生机制
• 1 B淋巴细胞和T淋巴细胞抗原受体的结构及分类
• 2 功能多样性产生机制
• 三、V（D）J重排机制与RAG蛋白
• 1 V（D）J 重排机制
• 2 RAG蛋白
• 3 重排反应相关因子
• 四、研究意义
• 第二章 ra91 和ra92 基因的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 引物序列
• 1.3 PCR反应体系及程序
• 1.4 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 牙鲆ra91 基因序列
• 2.2 牙鲆ra92 基因序列
• 2.3 基因间序列
• 3 讨论
• 3.1 rag基因的构成
• 3.2 rag基因的表达调控
• 3.3 RAG蛋白的分析
• 3.4 rag基因座位
• 第三章 牙鲆ra91 和ra92 基因的表达分析
• 1 材料和方法
• 1.1 组织特异性检测
• 1.2 探针制备
• 1.3 整装原位杂交
• 1.4 冰冻切片
• 1.5 石蜡切片原位杂交
• 2 实验结果
• 2.1 组织特异性表达
• 2.2 rag基因时空表达
• 3 讨论
• 3.1 基因表达水平的组织特异性
• 3.2 rag表达与胸腺的发生
• 3.3 胸腺的位置
• 第四章 RAG1 和RAG2 蛋白的原核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 引物序列
• 1.3 感受态细胞的制备及表达质粒转化
• 1.4 IPTG诱导浓度对重组蛋白表达量的影响
• 1.5 诱导时间对重组蛋白表达量的影响
• 1.6 蛋白可溶性确定
• 1.7 RAG2 蛋白的纯化
• 1.8 SDS-PAGE检测
• 2 实验结果
• 2.1 重组表达质粒的构建及表达蛋白分子量的确定
• 2.2 诱导时间对重组蛋白表达量的影响
• 2.3 IPTG浓度对重组蛋白产生量的影响
• 2.4 蛋白可溶性确定
• 2.5 RAG2 蛋白纯化结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢