论文摘要
Foxp3是FOX（forkhead box）家族转录因子中的一员,是调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的特异性标志,同时对Treg的发生、发育、功能的维持与发挥等方面起着关键作用。研究发现表达外源性Foxp3可使非调节性T细胞具有类似调节性T细胞样的表型及免疫抑制功能。Foxp3的突变可能导致调节性的CD4+CD25+T细胞介导的免疫耐受缺陷。HIV-1（human immunodeficiency virus type 1）基因编码的反式激活蛋白（transactivator,TAT）中的蛋白转导结构域（protein transductiondomain,PTD）能够携带外源性蛋白穿入几乎所有的真核细胞膜而进入细胞浆和细胞核内,同时具有高效、快速的特点。目的:构建带HIV-1穿膜序列原核表达载体pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3,表达并纯化小鼠PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白,研究融合蛋白导入细胞的效率及其对T细胞活化增殖的免疫调节功能的影响。方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta（DE3）中表达融合蛋白,经Ni2+分离柱纯化融合蛋白。Western-blot技术检测融合蛋白表达的正确性,流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白对T细胞活化增殖的影响。结果:成功构建了pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白。通过流式细胞术分析证实表达的融合蛋白均能高效的转入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应初步表明PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能明显抑制T淋巴细胞的活化增殖能力,而PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3突变体融合蛋白抑制T细胞活化增殖的能力丧失。结论:成功表达具有生物学活性的PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白,为进一步更好地研究Foxp3的免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3相关融合蛋白奠定了基础。